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洪燕，游媛，刘宁，龚玮，郑洋滨
江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029
细胞毒性检查法是将供试品或者供试品接触细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞的毒性作用，常用的方法有MTT 法、细胞计数法、碘化丙碇（PI）染色法等［1］。《国家药包材标准》中细胞毒性可分为相对增殖度法、琼脂扩散法、直接接触法和浸提法4 种［2］。
药用复合膜由各种塑料与纸、金属或者其他材料通过层合挤出贴面、共挤塑等工艺技术将基材结合在一起而形成的多层结构的膜，可用于直接接触各类药物制剂的包装，是药品的重要组成部分，厚度一般不大于0.25 mm［3-4］。在药用复合膜的生产过程中，为了改善膜材的质量及品质，或有利于加工生产，须加入一些化学助剂，如增塑剂、稳定剂、成核剂等［5］。复合膜在生产时会涂布黏合剂使不同的膜材进行复合，使用最多的为聚氨酯类胶黏剂，其中存在的芳香胺和有机溶剂也为有毒物质。其次大部分印刷的油墨中含有有毒有害物质，包括重金属、有机挥发物、残留的溶剂等等，这些均存在安全隐患［6］。
基于目前对复合膜原料的细胞毒性研究尚不完善，本次实验采用MTT 法，对18 种复合膜原料、2 种黏合剂添加物及9 种油墨添加物进行细胞毒性研究，为药包材质量的监督管理提供依据。
1.1 实验材料
L929 细胞（ATCC）、MTT［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑盐溴化物］、1640完全培养基、胎牛血清、生理盐水、二甲基亚砜（DMSO）。
1.2 仪器
电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］，酶标仪（赛默飞世尔科技公司），CO2恒温培养箱（赛默飞世尔科技公司），倒置显微镜（奥林巴斯株式会社）。
1.3 实验样品
试验选取6个厂家的不同批号复合膜18批（PET膜、PE 膜、VMPET 膜），黏合剂添加物2 种（2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯）和油墨添加物9 种［荧光增白剂KSN、荧光增白剂378、1,4-二（2-氰苯乙烯）苯、1,4-二（2-苯并唑基）萘、4,4,-双（2-苯并唑基）二苯乙烯、2,5-双（苯并唑-2-基）噻吩、7-二乙氨基-4-甲基香豆素、2,5-二(5-叔-丁基-2-苯并唑基)噻吩、荧光增白剂135］共29 个样本。
2.1 MTT 溶液的配制
取MTT 500 mg 溶于100 mL PBS 缓冲液中，浓度为5 mg/mL，过滤除菌，4 ℃避光保存。
2.2 样品浸提液的制备
见表1。
表1 供试品前处理
2.3 细胞毒性增殖度实验方法
取正常生长并处于对数生长期的L929 细胞，消化吹打计数，稀释至浓度为1×104/mL，精密吸取100 μL 细胞悬液注入细胞培养板内，放入含5%的CO2的恒温培养箱中37 ℃培养24 h。弃去原培养液，换成各种供试液，每组6 孔，同时设立阳性对照组（10% DMSO），阴性对照组（聚丙烯输液袋浸提液），空白对照组（1640 完全培养基各100 μL 每孔），再置细胞培养箱中37 ℃继续培养，同步实验。72 h 后，小心吸弃孔内上清液，每孔加入20 μL 浓度为5 mg/mL 的MTT 溶液，继续孵育培养4 h 后终止培养。小心吸弃孔内上清液，每孔分别加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上用双波长（570 nm、630 nm）测定各孔吸光度，计算相对增殖度（RGR），RGR=供试品吸光度/空白对照组吸光度×100%［7］。
2.4 结果判定标准
样品的细胞毒性可采用细胞毒性分级表评价，见表2。
表2 细胞毒性分级表
3.1 不同浸提条件对复合膜原料膜细胞毒性的影响
结果显示用3 种不同的浸提方法进行试验，RGR 值测定结果在80～110，细胞毒性分级在0～1，呈现无毒或轻微毒性，见表3。
表3 不同条件下复合膜原料膜细胞毒性试验结果 %
3.2 黏合剂添加物细胞毒性测定及比较
根据黏合剂添加物不同浓度的细胞增殖度，用SPSS 软件计算半抑制浓度（IC50）［8-9］。结果显示，2,4-二氨基甲苯在高浓度下（10～0.156）mg/mL 显示出极强的细胞毒性，毒性分级在3～4 级；
随着稀释倍数的增加（0.078～0.039）mg/mL，细胞毒性逐渐降低，毒性分级基本在1～2 级，呈现出轻微毒性。2,6-二氨基甲苯同样在高浓度下（10～0.625）mg/mL 下显示出极强的细胞毒性，毒性分级在3～4级；
随着稀释倍数的增加（0.313～0.039）mg/mL，细胞毒性逐渐降低，毒性分级基本在1～2 级，呈现出轻微毒性。不同浸提条件下，2,4-二氨基甲苯IC50值（0.06 9～0.124 mg/mL），均小于2,6-二氨基甲苯IC50值（0.370～0.566 mg/mL）,显示2,4-二氨基甲苯的L929 细胞毒性大于2,6-二氨基甲苯。见表4。
表4 黏合剂添加物不同浸提条件RGR和IC50测定结果
3.3 油墨添加物细胞毒性测定及比较
根据油墨添加物不同浓度的细胞增殖度，用SPSS 软件计算IC50。结果显示在37 ℃浸提条件，生理盐水为浸提介质下，8 种添加物在各个浓度下均无细胞毒性，毒性分级基本在1～2 级，呈现出轻微毒性；
1 种添加物7-二乙氨基-4-甲基香豆素在高浓度时下（10，5）mg/mL 显示出细胞毒性，毒性分级在3～4 级；
细胞毒性随稀释倍数的增加逐渐降低，毒性分级基本在0～2 级，呈现出轻微毒性或无毒。在37 ℃浸提条件，完全培养基为浸提介质下，6 种添加物在各浓度下无细胞毒性，毒性分级基本在1～2 级，呈现出轻微毒性。3 种添加物［荧光增白剂378，1,4-二（2-氰苯乙烯）苯，7-二乙氨基-4-甲基香豆素］在高浓度时呈现出细胞毒性，毒性分级在3～4 级，细胞毒性随稀释倍数的增加逐渐降低，毒性分级基本在0～2 级，呈现出轻微毒性或无毒。在121 ℃浸提条件，生理盐水为浸提介质下7 种添加物在各浓度下无细胞毒性，毒性分级基本在1～2 级，呈现出轻微毒性。2 种添加物［1,4-二（2-苯并唑基）萘，7-二乙氨基-4-甲基香豆素］在高浓度时呈现出细胞毒性，毒性分级在3～4 级，细胞毒性随稀释倍数的增加逐渐降低，毒性分级基本在0～2 级，呈现出轻微毒性或无毒。见表5。
表5 油墨添加物不同浸提条件RGR测定结果
复合膜原料膜用3种不同的浸提方法进行试验，细胞毒性分级在0～1，呈现无毒或轻微毒性。说明该类产品安全可靠。
黏合剂添加物试验结果显示，黏合剂添加物在37 ℃的浸提条件下显示出比121 ℃更强的细胞毒性，121 ℃浸提条件下的IC50值明显高于37 ℃浸提条件的IC50值。
油墨添加物结果表明，较高浓度的油墨添加物7-二乙氨基-4-甲基香豆素在不同的浸提条件及浸提介质下均表现出细胞毒性作用。在37 ℃浸提条件，培养基为浸提介质下更有利于有毒物质的浸出，而表现出更强的细胞毒性。
药用复合膜是固体制剂的主要包装材料,可用于直接接触各类药物制剂，是药品的重要组成部，为保证其使用的安全，减少不良反应的发生，应在其原有标准中增加细胞毒性检查项。
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