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李 灿， 王淑娟， 林 杰， 黄 金， 张 涛， 刘文举， 孔 亮， 庞训胜
(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)
随着养殖规模化和集约化,结合人工授精技术应用的定时输精在畜牧业发展上已展现出经济和技术优势[1]。基于经典Ovsynch衍生的多种卵泡同步发育技术程序被广泛应用于规模牛场[2],我国70%以上奶牛采用定时输精技术。定时输精业已拓展至山羊、绵羊等其他畜种[3-4]。
卵泡波是母羊卵巢卵泡发育成熟的机制[5]。Pursley等[6]发现外源促性腺激素释放激素(GnRH)可使发情周期奶牛启动新的卵泡波,通过促黄体素(LH)诱导排卵形成黄体,研究表明,新发育卵泡经过7 d至优势化,当采用PGF2消除黄体时,构成了群体母畜定时输精的基础。羊的卵巢生理不同于牛,卵泡可呈多卵泡共优势化和排卵现象[7]。黄淮山羊常年发情,但夏季发情比例低[8-9],因此,尽管孕酮(P4)和孕马血清促性腺激素(PMSG)常作为促使卵泡发育的激素,但是,定时输精技术在诱导羊卵泡发育和排卵的外源激素选择、剂量和处理方法等方面还存在诸多不足[3]。黄淮山羊是我国优良地方品种,本试验通过调整Ovsynch方案,研究其对山羊卵泡同步发育和发情的影响,旨在比较多种激素综合调节出现的发情特点,为进一步推进地方黄淮山羊品种的开发利用提供参考。
1.1 试剂和仪器
P4放射免疫分析盒(批号:210320，北方所协和医药);β雌二醇放射免疫分析盒(β-E2,批号:210320,北方所协和医药);氯前列烯醇钠(PG-CL,批号:S181012,宁波三生生物科技有限公司)；
PMSG(批号:B180906，宁波三生生物科技有限公司)；
促排3号(LHRH-A3,批号:S181209，宁波三生生物科技有限公司)；
黄体酮阴道缓释剂(CIDR,批号:C181001，宁波三生生物科技有限公司)；
促卵泡素(FSH,批号:B180921，宁波三生生物科技有限公司)。XH6080液体闪烁计数仪(西安核仪器厂生产)。
1.2 试验羊分组与处理
根据山羊繁殖季节特点,于1和6月份分别从临泉县欣达生态羊业有限公司和涡阳县三生万养殖专业合作社,选择2～4胎次繁殖性能正常、体况中等、体重25～40 kg的黄淮山羊断奶母羊50只,根据年龄和胎次均衡原则,分成Ⅰ～Ⅵ组,按照表1试验方案设计药物处理时间和方式,Ⅰ～Ⅴ组山羊在6月份试验,使用CIDR、LHRH-A3、PMSG、PG-CL和FSH;Ⅵ组山羊在1月份试验,使用LHRH-A3和PG-CL,且Ⅵ组山羊在每个药物处理节点的前1天和最后一针注射第2天,以间隔8 h从颈静脉采集3次血样1.5 mL,肝素钠抗凝,3 500 r/min离心20 min,取血浆置于样品管中,在-20 ℃下保存待测。
表1 卵巢卵泡同步发育处理方案
1.3 发情鉴定
母羊均为舍饲,以青粗饲料为主,适当补充精料。自最后1次注射PG-CL或撤除CIDR以降低体内孕激素后第2天开始,每天用试情公羊试情2次。当母羊喜接近公羊,尾巴摆动,接受爬跨即鉴定为发情。
1.4 指标测定
采用125I放射免疫测定P4和E2浓度,测定灵敏度分别为0.2 ng/mL血浆和1.4 pg/mL血浆。P4批内和批间平均变异系数分别为10%和15%;E2批内和批间变异系数分别为10%和15%。
降低孕激素至发情的间隔时间(P-发情)以及P-发情位于20～36、37～54、>70 h时间段的发情羊比例,GnRH首次处理至发情的间隔时间(GnRH-发情),发情持续时间、发情率。
1.5 统计分析
数据以平均值±标准误表示,用SPSS 20软件对数据作χ2或ANOVA分析,确定差异显著性。
2.1 卵泡同步发育调节对母羊发情的影响
由表2可见,生殖激素不同的试验组之间的母羊发情率,经χ2检验,差异极显著(P<0.01)。Ⅵ组在1月份的发情率为100%,与6月份各试验组的发情率相比较差异极显著(P<0.01)。Ⅱ和Ⅳ组发情率为75%,极显著高于Ⅲ组(P<0.01)和Ⅰ组(P<0.01)。Ⅰ组母羊的PMSG剂量最低(150 IU/只),发情率为37.5%(P<0.01)。表明利用激素调节卵泡同步发育,非繁殖季节的不同处理方式影响发情率,繁殖季节的发情率最高。
PG-CL处理或撤除CIDR致孕激素水平降低,母羊发情的间隔时间经方差分析,组间差异极显著(P<0.01)。Ⅴ组和Ⅳ组的PMSG处理剂量较高,剂量分别为350 IU/只和200 IU/只,Ⅴ组P-发情最长,极显著长于Ⅳ组(P<0.01),且33.33%母羊的P-发情>70 h,分布时间推迟;Ⅳ组显著长于Ⅱ组(P<0.05),极显著长于Ⅲ组(P<0.01)和Ⅵ组(P<0.01);Ⅱ组P-发情极显著长于Ⅲ组(P<0.01)。相对于其他各组,Ⅵ组平均P-发情最短(P<0.01、P<0.05),主要集中在26～39 h间。
对于GnRH-发情间隔时间,经方差分析,组间差异极显著(P<0.01)。相对于其他各组,Ⅴ组GnRH-发情最长(P<0.01),Ⅰ～Ⅱ组最短(P<0.01),两组间无显著差异(P>0.05)。Ⅲ～Ⅴ组之间呈极显著性的增长变化(P<0.01)。Ⅵ组GnRH-发情为(229.95±2.21) h,除Ⅴ组外,均长于其他各组(P<0.01)。表明促性腺激素处理方式和剂量影响低发情率季节母羊卵泡同步发育,繁殖季节卵巢生理活性强。
在发情持续时间上,经方差分析,组间差异极显著(P<0.01)。Ⅰ～Ⅱ组间差异不显著(P>0.05),且均显著长于其他组(P<0.01);Ⅵ组发情持续时间为(33.19±0.39) h,显著长于Ⅲ～Ⅴ组(P<0.01);Ⅴ组发情持续时间最短(P<0.01)。
表2 卵泡同步发育的母羊发情结果比较
2.2 1月份调节卵泡同步发育的母羊外周血E2和P4浓度变化
由表2可见,经激素处理母羊外周血E2和P4浓度,经方差分析,E2在D-1、D1、D8和D10之间差异不显著(P>0.05),P4组间差异极显著(P<0.01)。其中,对于P4量,D8显著和极显著高于D10、D1和D-1(P<0.05,P<0.01),D10、D1和D-1组之间差异不显著(P>0.05),D10最低为(14.77±1.99) ng/mL。对应D10的E2量高于其他各点,D-1的E2量最低。
表3 激素处理对母羊外周血浆E2和P4浓度的影响
3.1 激素调节卵泡发育对母羊发情率的影响
试验表明,消除黄体或撤除CIDR,降低孕激素水平,PMSG可提高母羊发情率,与Güven等[10]研究结果相同。PMSG结合卵泡FSH和LH受体促进卵泡发育增大,但是,牛的研究显示[11],排卵前外周血高浓度P4通过降低机体LH分泌量,影响PMSG对优势卵泡发育的促进作用,致使P4不同浓度间优势卵泡或排卵前卵泡壁及其血管区面积呈显著差异。卵巢卵泡血管性内膜是雌性动物重要的E2合成与分泌组织,对调节发情至关重要。本试验对于PMSG的注射,Ⅲ组和Ⅴ组在孕激素水平降低前1天,Ⅱ和Ⅳ组在孕激素水平降低的同一时间点,仅相差1天,但母羊发情率即出现不同,Ⅲ组和Ⅴ组山羊发情率低于Ⅱ和Ⅳ组,生理机制可能与牛的研究相同,其结果有待进一步证实。
山羊一般趋向短日照繁殖季节,黄淮山羊6月份的发情率低。有研究表明,山羊在6-7月份的非繁殖季节,卵巢机能处于相对静止状态,外周血P4浓度低[12],辅以外源性孕激素可促使母羊非繁殖季节的发情[13]。本试验对Ⅵ组山羊未作PMSG处理,发情率100%,显著高于其他组,表明1月份与6月份黄淮山羊卵巢生理活性存在不同。PMSG促使卵泡发育存在剂量依赖[10]。Ⅰ～Ⅴ组间的PMSG剂量逐只增加,发情率呈增加趋势,Ⅰ组山羊的发情率显著低(P<0.01)。由于一定量的激素水平对于卵泡的发育和成熟至关重要[11],Ⅰ组PMSG使用量为150 IU/只,因此,推测Ⅰ组PMSG剂量可能偏低,不足以激发维持卵泡发育。本试验Ⅱ和Ⅳ组山羊发情率75%的PMSG剂量分别为180 IU/只和200 IU/只,明显低于Güven等[10]和Priscila等[11]的相关报道,其结果可能源于卵泡的同步发育。本试验在经典Ovsynch基础上设计卵泡发育方案,群体山羊卵巢卵泡发育处于均一优势或排卵前卵泡阶段,正值PMSG发挥正向作用[11,14],因此,低剂量PMSG显示出对促进卵泡发育的敏感和均衡。
3.2 激素调节卵泡发育对卵泡同步发育的影响
调节羊卵泡同步发育,Ovsynch方案的前提是卵巢卵泡波的存在。非繁殖季节母羊大卵泡发育呈类似卵泡波的方式,P4短期处理可促使大卵泡数增加[15]。本试验对Ⅰ～Ⅴ组羊置入CIDR,在第1针剂LHRH-A3启动新卵泡波时[4],内源性P4量随即增加,Ⅵ组在第8天时P4显著性增高(P<0.05,P<0.01)为其佐证。处于发情季节的Ⅵ组羊,未作CIDR和FSH的处理,孕激素降低至发情的间隔时间集中在26～39 h间,GnRH处理至发情间隔时间为(229.95±2.21) h,这些反映繁殖季节卵泡波的发育状况。据报道,PMSG可强化卵泡募集[16],也可使非排卵大卵泡的发育[17]。Ⅴ组羊孕激素降低的时间比Ⅰ～Ⅱ组迟1天,从卵泡波发育过程看,发情出现的时间应提前或者至少与Ⅲ～Ⅳ组相同,但是,Ⅴ组羊出现发情的间隔时间明显滞后,这可能与PMSG用量偏高有关,进而导致Ⅴ组GnRH首次处理至发情间隔时间偏长的结果,当降低PMSG用量时,两个间隔时间的指标在Ⅳ组显示缩短趋势,直至Ⅰ～Ⅱ组最短。
FSH的半衰期短,多次处理可促进和维持大卵泡发育,LHRH-A3诱导大卵泡排卵或黄体化[2,4,17]。本试验对Ⅰ～Ⅴ组羊排卵前的卵泡进行诱导排卵,使发情持续时间变为非自然生理时长。有研究表明[15],非繁殖季节母羊大卵泡数和成熟卵泡直径均明显高于繁殖季节的卵巢,外周血液E2量并没有显著变化,本试验Ⅵ组在卵泡波发育过程所呈现的E2量,虽在卵泡期走势偏高,但也无显著差异。由于PMSG处理可延迟羊的发情时间,本试验Ⅰ～Ⅴ组间发情持续时间呈递减显著变化,可能与PMSG剂量的增加有关,但同时也与FSH和LHRH-A3的应用有关。
综上所述,在山羊低发情率季节采用卵巢卵泡同步发育的激素调节,CIDR+LHRH-A3+PG-CL+PMSG+FSH+LHRH-A3方案可使母羊发情率达到75%和卵泡同步发育,其中首次和第2次LHRH-A3至PG-CL处理间隔分别为7和4 d,PMSG应与PG-CL同天处理,剂量180～200 IU/只羊。处于发情季节山羊可采用PG-CL+LHRH-A3+PG-CL方案达到同步发情效果。
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