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李 虎，张安林， ，许 慧，成 佳，马 宁
(1 湖南华腾制药有限公司，湖南 长沙 410006；
2 长沙创新药物工业技术研究院有限公司，湖南 长沙 410006；
3 长沙医学院药学院， 湖南 长沙 410219)
随着化学工业和医药研发的飞速发展，全球范围内对药品的质量要求也水涨船高，使用多分散性的PEG修饰的药物分子已经逐渐不能满足生物医药市场对药物的高质量需求。而使用具有单一成分的单分散PEG代替多分散PEG是解决这一困难的行之有效的途径。单分散PEG的合成方法主要分为四类：单端延伸法、双端延伸法、链单端倍增法以及链双端倍增法。它们的合成纯度很高，但分子量越高的PEG的官能团化往往步骤较长，并且纯化都十分困难[8-10]。这是因为传统的单分散PEG合成方法一般在链延长和官能化过程中存在较为复杂的保护/脱保护过程，并且分离纯化需要通过柱层析方法，为了除去同系物杂质往往会降低分离速度以致合成效率降低。
单分散PEG是目前在生物医学领域中使用越来越多的药物修饰剂，适用于单抗等生物大分子修饰的单分散PEG具有非常重要的应用价值。单分散PEG的官能团化，能够为生物医药以及材料科学提供诸多十分有价值的中间体[11-13]。所以开发一系列高效、经济、实用的单分散PEG的制备方法来满足生物药的快速发展已经迫在眉睫。本文研究了二乙二醇双官能团化乙酸的合成方法，其工艺如图1所示，同时开发出一套衍生化分析方法对其纯度和杂质进行了分析表征。
图1 二乙二醇双羧酸的合成工艺Fig.1 Synthesis of diethylene glycol dicarboxylic acid
1.1 仪器与试剂
400 MHz牛津中科高分辨核磁共振波谱仪；
Waters e2695型高效液相色谱；
二乙二醇,陶氏化学(中国)有限公司；
溴乙酸叔丁酯,国药集团化学试剂有限公司；
浓盐酸,科隆化学品有限公司；
其他常用试剂规格均为市售分析纯。
1.2 CM-PEG2-CM 3的合成
碱A为40%氢氧化钠溶液(40%NaOH aq.)，固体氢氧化钠(NaOH)，氢化钠(NaH)，叔丁醇钾(t-BuOK)，1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)中的一种。溶剂B为四氢呋喃(THF)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)， N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的一种。
将10 g(0.094 mol，1 eq)二乙二醇加入到500 mL反应瓶中，加入200 mL溶剂B，于20 ℃搅拌下加入碱A(3 eq)，然后滴加溴乙酸叔丁酯40 g(0. 207 mol，2.2 eq)，反应体系继续搅拌12 h，TLC检测反应结束。加入150 mL水，然后用乙酸乙酯200 mL×2萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，将有机相减压蒸除溶剂得到粗品，粗品经柱层析纯化后得到化合物2。1H NMR(400 MHz， CDCl3) δ 4.02(s， 1H)， 3.79～3.63(m， 1H)， 1.47(s， 1H)。
将2(10 g)加入到100 mL反应瓶中，加入4 M盐酸溶液，反应体系升温至65 ℃，搅拌6 h。冷却至室温，加入50 mL乙酸乙酯洗涤一次，再用50 mL二氯甲烷洗涤一次。减压蒸除水分，得到6 g产品CM-PEG2-CM(3)，淡黄色粘稠液体，收率：90%。1H NMR(400 MHz， D2O) δ 4.14(s， 1H)， 3.66(d，J=7.9 Hz， 1H)。
1.3 CM-PEG2-CM的衍生化分析方法
将22.2 mg的CM-PEG2-CM溶解在1 mL二氯甲烷中，加入64.5 mg的DIPEA，充分搅拌后缓慢滴加29.8 mg的 SOCI2溶液(溶解在2 mL二氯甲烷中)搅拌2 h。然后将42.8 mg苄胺加进反应体系继续反应30 min，结束后将反应液用乙腈转移到100 mL容量瓶中，定溶至100 mL后直接进样进行HPLC检测分析。
2.1 碱和溶剂对化合物2收率的影响
二乙二醇与溴乙酸叔丁酯通过亲核取代反应获得化合物2，该步反应是整个反应的最重要步骤，反应的收率和所得化合物2的纯度将对产品3的质量产生决定性影响。然而由于溴乙酸叔丁酯的亚甲基氢较为活泼，导致溴乙酸叔丁酯参与的亲核取代反应普遍由于副反应而导致收率极低[14]，而见诸报道的亲核试剂经常选择氢化钠，并且氢化钠用量往往较大，氢化钠的易燃性决定了该反应体系存在重大安全隐患而无法实现规模化工业生产，所以筛选合适的亲核反应体系对于化合物3的产业化意义重大。为了筛选最佳的反应条件，对反应使用的碱和溶剂做了对比试验，结果如表2所示，从表2中看出使用氢化钠做碱和NMP作为溶剂可以得到最高的收率为35%，将氢化钠替换成普通的碱NaOH后，中间体2的收率达到了32%。虽然比氢化钠参与的反应收率低一些，但是安全性获得极大优化。
表2 碱和溶剂对收率的影响Table 2 Influence of alkali and solvent on yield
2.2 碱和溶剂对杂质的影响
在产品3的工艺质量控制方面，一方面是产品收率，另一方面更重要的是杂质鉴定和控制。我们对表1所述条件下的所有批次产物进行了HNMR、LC-MS以及衍生化HPLC分析。发现各条件下获得的化合物3的HNMR图谱基本没有区别，但是如图2所示LC-MS分析发现，条件1～15对应获得的产品3均除了有目标特征离子峰223.2 m/z之外，还或多或少出现了一个明显的杂质离子峰281.0 m/z。我们推测该杂质对应的结构式如图2中所示的3a，它是合成工艺中第一步反应产生的副产物2a经水解得到的。
图2 产品3的LC-MS分析图谱Fig.2 LC-MS analysis of product 3
我们选取部分条件下得到的产品3进行苄胺衍生化HPLC分析，结果如图3所示。产品3的苄胺衍生物保留时间在16.1 min，而所有条件下获得的产品3的衍生化主要涉及两个杂质，保留时间分别在14.9 min和17.3 min。14.9 min经分析是产品3的单苄胺衍生物，是衍生化不完全造成的，故14.9 min对应的衍生化杂质可以忽略，而17.3 min对应的是杂质3a的苄胺衍生物，很明显该杂质与主峰保留时间十分接近，对应的杂质3a在产品3中亦很难实现纯化分离。从图3a和图3b中可以看出，40% NaOH条件下对应获得的产物3中会出现大量杂质3a(6.2%)，而此杂质在95%NaOH条件下对应的产物中发现明显减少(1.32%)，同时在其它碱作为亲核试剂条件下对应产品中的该杂质含量均低于0.5%(图3c～g)。我们推测是反应步骤1中，由于有水的存在，反应中会产生杂质2a，此杂质在化合物2的检测中难以发现，后经水解步骤后产生杂质3a，3a与产品3的理化特征几乎一模一样，难以鉴别，同时无法通过常规方法将3a从产品3中分离除去。而使用氢化钠和叔丁醇钾对应得到的产品之所以含有的杂质较少(图3d～e)，主要是因为氢化钠和叔丁醇钾可以和水发生反应，从而起到对反应体系除水的目的，相应产生较少的杂质。图3a～b图谱对应的工艺使用氢氧化钠水溶液作为碱，中间体2以及过量的溴乙酸叔丁酯会在碱性条件下部分水解，水解产物之间再次发生反应而产生杂质中间体2a，并在后续反应中水解为杂质3a。工艺中水的存在不仅影响产物纯度也极大降低产物收率。可见该工艺的关键杂质控制条件为水分，即需要在严格无水条件下才能获得高纯度的产品3。
图3 产品3的苄胺衍生化HPLC分析图谱Fig.3 HPLC analysis of benzylamine derivatization of product 3
2.3 温度对化合物2收率的影响
由于工艺步骤中反应条件氢氧化钠与氢化钠对应的产物收率相当，但在安全性和产业化前景上，氢氧化钠比氢化钠更具有优势。所以反应条件上选择固体氢氧化钠作为最佳条件，在严格控制反应体系水分的基础上研究了温度对反应的影响。从表3中看出在25 ℃和35 ℃条件下核心中间体2的收率基本没有变化，但随着温度的进一步升高，收率明显减少。所以此反应的温度在25～35 ℃为宜。
表3 NaOH反应条件下温度对收率的影响Table 3 Effect of temperature on yield under reaction condition NaOH
本文以二乙二醇和溴乙酸叔丁酯为原料，通过对反应条件的筛选，确定最优反应条件为固体氢氧化钠为碱，N-甲基吡咯烷酮为反应溶剂，25～35 ℃为反应温度，制得二乙二醇双羧酸衍生物，并对其做了表征。该工艺安全可靠，产品杂质含量较低，适合工业化生产。
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