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耿 雪，张建华，陈 艾
1.西部战区总医院检验科，四川成都 610000；
2.重庆医科大学附属第三医院检验科，重庆 401120
急性髓系白血病(AML)是一组高度异质性、恶性、克隆性血液肿瘤，由骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性肿瘤等血液相关疾病及肿瘤相关放化疗引起[1]。AML发病涉及多种基因融合和突变，基因组学改变与AML的发病、发展和预后有明确的相关性[2]。多药耐药基因(MDR1)是调控肿瘤耐药的基因，其表达可促使癌细胞对抗肿瘤治疗产生耐药，导致治疗失败、肿瘤复发转移及预后不良[3]。SOX4是SOX转录因子家族成员，在细胞生长发育，以及恶性肿瘤细胞增殖、扩散中均发挥重要作用[4]。Wilms瘤基因1(WT1)是一种有效的转录调节因子，与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移和血管生成相关[5]。本研究拟探讨MDR1、SOX4、WT1在AML中的表达特点，分析其与AML临床特征及预后的关系，现报道如下。
1.1一般资料 选取2020年1月至2021年8月本院收治的149例AML患者作为AML组，其中男89例，女60例；
年龄50～68岁，平均(59.25±4.27)岁；
AML分型：M1型12例，M2型85例，M3型15例，M4型16例，M5型20例，M6型1例。纳入标准：(1)经骨髓细胞形态学检查确诊为AML，符合2016年世界卫生组织制定的造血和淋巴组织肿瘤诊断标准[6]；
(2)年龄18岁以上。排除标准：(1)淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等其他血液系统疾病患者；
(2)合并实体肿瘤患者；
(3)入组前接受过化疗、免疫或靶向治疗的患者。另选取同期于本院行骨髓检查无明显异常的72例轻度贫血(血红蛋白90～120 g/L)患者作为对照组，其中男42例，女30例；
年龄48～69岁，平均(59.07±4.31)岁。AML组和对照组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已经获得本院伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。
1.2骨髓MDR1、SOX4、WT1检测方法 取骨髓穿刺获得的骨髓组织标本2～3 mL，分离白细胞，加入红细胞裂解液裂解红细胞。常温下以1 500 r/min离心(离心半径10 cm)5 min，弃上清液。采用Wizard®SV Genomic DNA Purification Kit组织DNA提取试剂盒(美国Promega生物公司)提取RNA，采用cDNA试剂盒(美国赛默飞公司)将RNA反转录为cDNA，取2 μL cDNA样品加入实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)体系，采用CFX96实时定量PCR系统(美国BIO-RAD公司)进行PCR。引物由上海捷瑞公司合成，引物序列如下。MDR1 mRNA上游：5′-GCTGTCAAGGAAGCCAATGCCT-3′；
下游：5′-TGCAATGGCGATCCTCTGCTTC-3′。SOX4 mRNA上游：5′-GTGAGCGAGATGATCTCGGG-3′；
下游：5′-CAGGTT GGAGATGGACTC-3′。WT1 mRNA上游：5′-ACAGGGTACGAGAGCGATAACCA-3′；
下游:5′-CACACGTCGCACATCCTGAAT-3′。β-actin(内参)上游：5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′；
下游：5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。反应体系，DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 μL，RNase-Free ddH2O 21 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，98 ℃变性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循环30次。采用2-ΔΔCt的方法计算MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA相对表达水平。
1.3随访 出院后电话随访至2021年10月，统计随访期间总生存情况，总生存时间为自病理确诊到全因死亡或随访结束。
2.1AML组和对照组骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平比较 AML组骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 AML组和对照组骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平比较
2.2不同临床特征AML患者骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平比较 白细胞计数≥40×109/L、有器官浸润、治疗后非完全缓解AML患者骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平均高于白细胞计数<40×109/L、无器官浸润及治疗后完全缓解患者，差异均有统计学意义(P<0.05)；
不同年龄、性别、AML分型、血小板计数患者MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 不同临床特征AML患者骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平比较
2.3不同MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平AML患者总生存率比较 149例AML患者随访期间失访5例，余144例中死亡48例，MDR1 mRNA、SOX4 mRNA及WT1 mRNA高表达AML患者总生存率均低于MDR1 mRNA、SOX4 mRNA及WT1 mRNA低表达AML患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1、表3。
注：A为不同MDR1 mRNA表达水平患者生存曲线；
B为不同SOX4 mRNA表达水平患者生存曲线;C为不同WT1 mRNA表达水平患者生存曲线。
表3 不同MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平AML患者总生存率比较[n(%)]
2.4影响AML患者预后的单因素Cox比例风险回归分析 以AML患者生存情况作为因变量，纳入年龄、性别、AML分型、白细胞计数、血小板计数、器官浸润、治疗后缓解情况、MDR1 mRNA表达水平、SOX4 mRNA表达水平、WT1 mRNA表达水平作为自变量(表4)。单因素Cox比例风险回归分析(ENTER法)结果显示，有器官浸润、治疗后非完全缓解、MDR1 mRNA高表达、SOX4 mRNA高表达、WT1 mRNA高表达与AML患者预后有关(P<0.05)，见表5。将单因素分析中差异有统计学意义的项目纳入多因素Cox比例风险回归分析(ENTER法)，结果显示，治疗后非完全缓解、MDR1 mRNA高表达、SOX4 mRNA高表达、WT1 mRNA高表达是AML患者预后不良的危险因素(P<0.05)，见表6。
表4 赋值表
表5 影响AML患者预后的单因素Cox比例风险回归分析
表6 影响AML患者预后的多因素Cox比例风险回归分析
AML是一组高病死率的恶性肿瘤，由骨髓干细胞克隆异常增殖和分化引起，发病机制涉及遗传、环境改变、染色体易位及基因突变等，大多数患者出现白细胞增多伴骨髓衰竭迹象(贫血和血小板减少)及疲劳、厌食和体质量减轻，少数患者可出现淋巴结肿大和器官肿大，如果不及时治疗，通常会在诊断后数月内因感染或出血而死亡[1]。过去40年，AML的治疗一直局限于高剂量细胞毒性化疗，近年来，随着深度测序技术的发展和靶向药物的应用，具有更高疗效的化疗和更低毒性的靶向疗法逐渐应用于临床，但是靶向药物耐药、治疗毒性叠加效应等给治疗带来新的挑战[7]，患者预后仍然不是十分理想[8]。
MDR1是一种三磷酸腺苷(ATP)依赖性跨膜转运蛋白，由ABCB1基因编码，位于染色体区域7q21上，在肠道、结肠、胎盘、肝脏、血脑屏障等多种组织中表达，通过减少敏感器官或细胞中异生物质的积累发挥保护作用[9]。MDR1编码的糖蛋白是一种糖基化膜蛋白，属于膜转运蛋白的ATP结合超家族成员，嵌于细胞膜上，作为膜通道可将细胞内底物泵出细胞外，降低细胞内药物浓度，进而产生耐药[10]。MDR1在肿瘤细胞中充当化疗药物外排泵，是癌细胞对化疗耐药的主要机制之一。有研究结果显示，MDR1多态性可改变蛋白质表达或功能，与结直肠癌化疗药物反应性有关[11]。MDR1基因表达增加降低癌细胞中具有细胞毒性的抗癌药物浓度，并导致多药耐药表型，与神经母细胞瘤、乳腺癌等多种癌症化疗后预后不良有关[12]。本研究结果显示，AML患者骨髓中MDR1 mRNA表达水平增加，并且其高表达与白细胞计数增加、有器官浸润、治疗后非完全缓解及预后不良有关，说明MDR1 mRNA高表达与AML进展、治疗反应性差及预后不良有关。KASSEM等[13]在报道中指出，MDR1基因表达水平在AML耐药患者中明显升高，MDR1基因高表达与低完全缓解率和低生存率有关。推测MDR1可能通过诱导AML对抗肿瘤治疗耐药参与其进展过程。
SOX家族由参与细胞和器官发育分化及癌症发生和发展的转录因子组成，SOX4是SOX家族中一种重要的发育转录因子，含474个氨基酸残基，参与骨和心脏等器官发育，与骨质疏松症、癌症等多种疾病有关[14]。目前，已知SOX4在20多种恶性肿瘤中呈高表达，通过与其他转录因子相互作用促进癌细胞存活、上皮间充质转化、癌细胞迁移和转移[15]。有研究显示，SOX4可直接或间接负调节 WNT5a水平，增加膀胱癌细胞侵袭性[16]，在晚期前列腺癌中，SOX4通过靶向上调miR-17-92表达水平，下调RB1蛋白表达水平，促使癌细胞增殖[17]。本研究发现，SOX4 mRNA在AML患者骨髓中呈高表达，是AML预后不良的危险因素，表明SOX4在AML中发挥致癌基因作用。LU等[18]研究认为，SOX4是急性白血病发病的重要启动因子，与AML患者预后不良独立相关。SOX4可能通过调控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路参与AML的发病过程[19]，也可能诱导Rho GTPase激活蛋白9表达上调，促使AML细胞增殖，抑制其凋亡，促使癌症进展[20]。
WT1最初被鉴定为Wilms肿瘤的候选基因，进一步研究表明，WT1可调节一系列靶基因和信号途径参与细胞发育、器官形成、组织稳态维持及疾病发病过程[21]。有研究表明，WT1 mRNA在乳腺癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等多种恶性肿瘤中异常表达，发挥致癌基因作用，在乳腺癌中WT1 mRNA表达水平增加，抑制WT1 mRNA表达水平可降低细胞周期蛋白D1表达，抑制癌细胞增殖，促使癌细胞凋亡[22]。WT1 mRNA在多形性胶质母细胞瘤中呈高表达，发挥促进癌细胞增殖和迁移作用[23]。本研究发现，WT1 mRNA在AML中表达水平增加，WT1 mRNA高表达与AML患者预后有关，证明WT1在AML中发挥致癌基因作用。PANDEY等[24]研究结果显示，WT1 mRNA在急性早幼粒细胞白血病患者骨髓样本中表达水平增加，WT1 mRNA高表达可上调白血病细胞中细胞周期蛋白A1 mRNA表达水平，促进癌细胞增殖。
综上所述，AML患者骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平均增加，Cox比例风险回归分析结果显示，MDR1 mRNA高表达、SOX4 mRNA高表达、WT1 mRNA高表达与AML患者预后不良有关，提示MDR1、SOX4、WT1均参与了AML的发病机制，可为AML病情评估、预后预测及靶向治疗提供参考。本研究局限之处在于随访时间过短，MDR1、SOX4、WT1与AML患者预后的关系尚有待进一步延长随访时间加以证实。
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