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周伦 丁源 吕洲
青岛市市立医院骨关节科，青岛 266000
骨关节炎是常见的骨骼疾病，疼痛、僵硬等临床特征严重影响关节的承重能力，我国有80%的患者出现关节活动受限，严重影响患者的生活质量［1］。目前关于该病的研究表明，骨关节炎主要是由于细胞外基质、关节软骨的合成、降解紊乱所造成［2］。当前基于微小RNA（miRNA）治疗多种疾病已有大量研究，同时对于临床具有较大的诊断、治疗潜能，但治疗骨关节炎的研究较少［3］。有研究表明，微小核糖核酸-34a（microRNA-34A，miR-34a）具有调控细胞周期和抗增殖能力，同时表达异常会引起细胞的凋亡、细胞周期停滞等现象［4］。蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路主要对于细胞的调控、自噬具有重要作用，其中通过抑制该通路可以改善机体的炎性反应［5］。目前缺少通过AKT/mTOR 信号通路来调节miR-34a 对骨关节炎的干预效果研究。基于此，本文旨在研究miR-34a 基于AKT/mTOR通路对骨关节炎大鼠的影响及作用机制。
1、研究动物
研究时间为 2020 年 2 月至 2021 年 5 月。选取 43 只 6～9 周龄雄性SD 大鼠作前瞻性研究，体质量200～250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2017-0022，喂养标准大鼠饲料，室温（24±3）℃，相对湿度（48±7）%，12 h 光照交替。本次试验操作均参照动物试验伦理要求的相关规定，且经青岛市市立医院伦理委员会批准同意。
2、方法
2.1、骨关节炎大鼠建模［6］选取 43 只大鼠，从中随机选取10 只大鼠为空白组，其余33 只建立骨关节炎模型大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，H37022673）麻醉，切开2 cm 双侧膝关节内侧，暴露关节腔，用生理盐水清洗，止血，缝合。在关节中注射碘乙酸钠溶液（上海信裕生物科技有限公司，型号305-53-3），饲养2 周，建模关节出现肿胀及屈伸功能障碍，表示建模成功。成功建模30只。
2.2、分组及干预 选取10 只大鼠为空白组，成功建模的30 只模型大鼠随机分为模型组、上调miR-34a 组、沉默miR-34a 组，各 10 只。通过 Lipofectamine 2000 将 miR-34a inhibitor 转染到上调 miR-34a 组、沉默 miR-34a 组，分别为400 nm 和 200 nm，6 h 后换成含10% 血清的DMEM 培养基（广东环凯生物科技有限公司，货号：XB01XLS），37 ℃，CO2培养箱培养48 h，实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测miR-34a inhibitor 转染效果。模型组、空白组均给予等体积的生理盐水干预，各组均连续干预2周。
2.3、检测炎症指标 采用酶联免疫吸附测定法检测白细胞介素（interleukin，IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-4、IL-10，在干预结束后抽取尾静脉血5 ml，以离心半径5 cm、转速3 000 r/min 离心处理10 min，分离上层血清，-80 ℃保存待检。严格按照说明书进行。酶联免疫吸附试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供。
2.4、病理组织观察 干预50 d 后，处死大鼠，观察关节是否有积液，取4 块胫骨内侧、胫骨外侧为标本，标本使用中性甲醛溶液固定70 h，脱水，包埋，切片，苏木精-伊红（HE）染色，根据Mankin关节软骨病理评分标准进行评估。
2.5、采用实时荧光定量PCR 检测miR-34a 采用Trizol一步法提取总RNA，所有步骤按说明书严格进行。引物设计如下 ， miR-34a正 向引物 ：5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ， 反 向 引 物 ：5’-GCCGCTGGCAGTGTCTTAGCTG-3’；
GAPDH正向引物：5’ -AGCCACATCGCTCAGACA-3’ ， 反 向 引 物 ：5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’。采用 2-△△Ct方法计算出需要检测的miR-34a相对表达量。
2.6、检测磷酸化蛋白激酶B（pAKT）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（pmTOR） 采用蛋白免疫印迹法将标本提取液，根据蛋白浓度取适量进行SDS-PAGE 电泳分离蛋白。其余步骤严格按照说明书进行，结果用LabWorks3.0软件以目的条带β-肌动蛋白（β-actin）的会度值进行分析。重复试验5次。
3、统计学处理
采用SPSS 19.0 统计软件进行分析处理。应用Kolmogorov-SmiRnov 检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）描述，多组间比较采用方差齐性检验，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
1、病理组织
如图1 所示，图1A 为空白组：未见明显关节结构破坏，表面光滑没有裂痕，骨细胞排列分布均匀；
图1B 为模型组：表面明显粗糙，有裂隙，骨细胞减少偏平，分布紊乱；
图1C为沉默miR-34a 组：表面较为光滑无裂痕，骨细胞分布均匀，层次分明；
图1D 为上调miR-34a 组：表面粗糙，骨细胞减少，分布较为紊乱。
图1 各组大鼠病理学观察（HE ×400）。A 为空白组大鼠病理图，B 为模型组大鼠病理图，C 为沉默miR-34a 组大鼠病理图，D为上调miR-34a组大鼠病理图
2、miR-34a在各组中的表达水平比较
如表1 所示，与空白组相比，模型组、上调miR-34a 组、沉默miR-34a 组的miR-34a 表达较高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
与模型组相比，上调 miR-34a 组、沉默miR-34a组miR-34a表达较低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
沉 默 miR-34a 组 与 上调 miR-34a 组相 比，沉 默miR-34a 组miR-34a 表达较低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。
表1 miR-34a在各组大鼠中的表达水平比较（）
表1 miR-34a在各组大鼠中的表达水平比较（）
注：空白组不做处理，模型组建立骨关节炎模型，上调miR-34a组、沉默miR-34a 组建立骨关节炎模型后分别转染400 nm 和200 nm miR-34a inhibitor；
miR-34a 为微小核糖核酸-34a；
与空白组相比，aP＜0.05；
与模型组相比，bP＜0.05；
与上调miR-34a 组相比，cP＜0.05
miR-34a 0.94±0.08 2.39±0.26a 2.12±0.23ab 1.54±0.17abc 25.290 0.001组别空白组模型组上调miR-34a组沉默miR-34a组F值P值n 10 10 10 10
3、各组Makin评分比较
如表2 所示，与空白组相比，模型组、上调miR-34a 组、沉默miR-34a 组的Makin 评分较高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；
与模型组相比，上调miR-34a 组、沉默miR-34a 组的Makin 评分较低，差异有统计学意义（均P＜0.05）；
沉默miR-34a 组与上调 miR-34a 组相比，沉默 miR-34a 组 Makin评分较低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。
表2 Makin评分在各组大鼠中的比较（分，）
表2 Makin评分在各组大鼠中的比较（分，）
注：空白组不做处理，模型组建立骨关节炎模型，上调miR-34a组、沉默miR-34a 组建立骨关节炎模型后分别转染400 nm 和200 nm miR-34a inhibitor；
miR-34a 为微小核糖核酸-34a；
与空白组相比，aP＜0.05；
与模型组相比，bP＜0.05；
与上调miR-34a 组相比，cP＜0.05
Makin评分0.35±0.05 4.13±0.19a 3.02±0.16ab 1.15±0.09abc 91.260 0.001组别空白组模型组上调miR-34a组沉默miR-34a组F值P值n 10 10 10 10
4、各组炎性反应比较
如表3 所示，与空白组相比，模型组、上调miR-34a 组、沉默miR-34a组IL-1β、TNF-α较高，IL-4、IL-10较低，差异有统计学意义（均P＜0.05）；
与模型组相比，上调miR-34a组、沉默 miR-34a 组IL-1β、TNF-α 较低，IL-4、IL-10 较高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；
沉默miR-34a 组与上调miR-34a 组相比，沉默 miR-34a 组 IL-1β、TNF-α 较低，IL-4、IL-10较高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。
表3 各组大鼠的炎性反应比较（）
表3 各组大鼠的炎性反应比较（）
注：空白组不做处理，模型组建立骨关节炎模型，上调miR-34a 组、沉默miR-34a 组建立骨关节炎模型后分别转染400 nm 和200 nm miR-34a inhibitor；
miR-34a 为微小核糖核酸-34a；
IL 为白细胞介素，TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；
与空白组相比，aP＜0.05；
与模型组相比，bP＜0.05；
与上调miR-34a组相比，cP＜0.05
IL-10（pg/ml）106.49±17.51 60.85±10.23a 76.81±13.07ab 91.05±15.02abc 10.676 0.001组别空白组模型组上调miR-34a组沉默miR-34a组F值P值n 10 10 10 10 IL-1β（ng/L）3.68±0.37 7.51±1.23a 5.72±0.95ab 4.63±0.72abc 14.144 0.001 TNF-α（ng/L）37.45±4.85 62.05±7.49a 56.26±6.25ab 43.85±5.10abc 13.077 0.001 IL-4（pg/ml）115.75±16.81 50.43±9.42a 75.82±11.94ab 93.85±13.86abc 16.080 0.001
5、各组AKT/mTOR通路蛋白相对表达量对比
如表4 所示，与空白组相比，模型组、上调miR-34a 组、沉默miR-34a组pAKT、pmTOR较高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；
与模型组相比，上调miR-34a 组、沉默miR-34a 组pAKT、pmTOR 较低，差异有统计学意义（均P＜0.05）；
沉默miR-34a组与上调miR-34a组相比，沉默miR-34a组pAKT、pmTOR 较低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。各组大鼠pAKT、pmTOR蛋白免疫印迹图见图2。
图2 空白组、模型组、沉默miR-34a组、上调miR-34a组大鼠pAKT、pmTOR蛋白免疫印迹图
表4 各组大鼠的pAKT、pmTOR蛋白相对表达量对比（）
表4 各组大鼠的pAKT、pmTOR蛋白相对表达量对比（）
注：空白组不做处理，模型组建立骨关节炎模型，上调miR-34a组、沉默miR-34a组建立骨关节炎模型后分别转染400 nm和200 nm miR-34a inhibitor；
miR-34a 为微小核糖核酸-34a，pAKT 为磷酸化蛋白激酶，pmTOR 为雷帕霉素靶蛋白；
与空白组相比，aP＜0.05；
与模型组相比，bP＜0.05；
与上调miR-34a组相比，cP＜0.05
pmTOR 1.00±0.01 1.89±0.24a 1.56±0.25ab 1.25±0.15abc 17.580 0.001组别空白组模型组上调miR-34a组沉默miR-34a组F值P值n 10 10 10 10 pAKT 1.00±0.01 1.95±0.29a 1.71±0.26ab 1.51±0.26abc 15.525 0.001
骨关节炎是一种退行性疾病，主要是以关节基质破坏、关节软骨细胞减少为特点，严重者可导致患者出现关节畸形、功能丧失等问题，当时该病的发病机制尚未明确［7］。关于该病的治疗目前没有较好的方法，主要是以减轻疼痛、改善关节功能为主要治疗方式，以提高生活质量为主要目的［8］。但是治疗方式不甚理想，因此应更加深入了解病理机制，挖掘防治靶点。
miRNA 是一种普遍存在于生物体的小分子，其可以通过调节别的miRNA 来实现基因的调控，参与多种疾病中，尤其对于人体神经分化、细胞凋亡、增殖具有重大作用，是一重要的调节因子［9-10］。随着对miRNA 的深入了解发现，miR-34a 与骨质疏松症、骨肿瘤、骨关节炎等疾病的发生、发展具有密切关系。主要是因为miR-34a 可调节细胞增殖、凋亡等生理学行为［11-12］。有研究结果显示，通过miR-34a 进行沉默，可以起到保护软骨细胞的作用，同时可以抑制软骨细胞凋亡，延缓关节退变的速度，对于治疗骨关节炎提供了较好的理论支持［13］。本文研究结果显示，在骨关节炎中miR-34a 表达较高，通过沉默miR-34a 可以降低大鼠miR-34a 表达，减轻大鼠的炎性反应，从而影响骨关节炎的发生、发展。主要是因为miR-34a 通过诱导p53 基因，进而导致细胞周期停止、凋亡、衰老等生物学行为，同时通过导致基因的变化对细胞进行较好的干预，因此对骨关节炎造成一定的影响［14］。
IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 是较为经典的炎性指标，对于骨关节炎的发病机制有一定影响。miR-34a 对于细胞的自噬作用有一定影响，而自噬是机体中较为稳态的一种机制，主要是通过吞噬受损的细胞器、蛋白质，从而释放原料，为机体提供新的能量，因此在炎症、免疫等指标中具有重要作用［15］。由此说明，miR-34a 对于炎症指标有一定影响性。本文研究结果显示，沉默miR-34a 可以使骨关节炎大鼠的IL-1β、TNF-α降低，IL-4、IL-10升高，减轻炎性反应。主要是因为IL-1β 可以诱导软骨产生较多的IL-6、IL-8 等炎症介质［16］。TNF-α 可抑制软骨胶原产生，与病变具有密切关系［17］。IL-10对软骨细胞具有保护作用，充分说明该炎症指标与骨关节炎的发生、发展具有密切的相关性。
mTOR 与细胞的增殖、凋亡、分化具有密切的相关性，同时有学者研究发现，以mTOR 为交点的正向信号通路有AKT/mTOR 通路［18］。同时有研究表明，AKT/mTOR 参与调控细胞的凋亡、自噬，可以影响更多的反向效应分子，从而起到抑制细胞自噬作用［19］。本文研究结果显示，沉默miR-34a可以降低骨关节炎大鼠pAKT、pmTOR 表达。分析原因主要是因为沉默miR-34a 可以通过去磷酸化的三磷酸磷脂酰肌醇抑制AKT 活性，而激活AKT/mTOR 信号通路之后，可以引起一系列反应，包括调控细胞的生长、增殖、自噬［20］。
综上所述，沉默miR-34a 通过AKT/mTOR 信号通路调控，进而改善pAKT、pmTOR 表达，提高大鼠的关节功能，减少炎性反应，为临床骨关节炎靶向治疗提供理论依据。但因样本量较少，在数据统计时可能存在一定的偏倚，存在一定的局限性，且未对其具体作用机制进行深入分析，因此还需后续进一步分析。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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