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白永明，巴依尔塔，李晓艳，姜永玲，李瑞刚，赵雷增，杜晨光，姜兰剑，郭 宇0，乌日罕7，
（1.巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心，内蒙古巴彦淖尔 015000；
2.通辽市动物疫病预防控制中心，内蒙古通辽 028000；
3.呼和浩特市动物疫病预防控制中心，内蒙古呼和浩特 010032；
4.赤峰市动物疫病预防控制中心，内蒙古赤峰 024099；
5.内蒙古自治区农牧厅，内蒙古呼和浩特 010010；
6.内蒙古玺腾科技发展有限公司，内蒙古呼和浩特 010020；
7.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头 014109；
8.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010010；
9.内蒙古岭鑫机电设备有限公司，内蒙古呼和浩特 010020；
10.内蒙古自治区动物疫病预防控制中心，内蒙古呼和浩特 010020；
11.内蒙古自治区农畜产品质量安全中心，内蒙古呼和浩特 010013）
1977 年，第一代基因测序技术问世，基因组学开创；
2005—2010 年，第二代基因测序技术商用，开启高通量时代；
2010—2014 年，以单分子为特点的第三代基因测序技术登场。纳米孔测序技术是牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）研发的第三代基因测序技术，其初始技术概念出现于 1989 年，是通过电泳对穿过纳米级孔道的单链 DNA 进行测序[1]。2014年，ONT 推出了首个商用纳米孔测序仪 MinION。2021 年12 月，国产纳米孔测序仪齐碳科技QNome-3841 量产。近年来，纳米孔测序技术发展迅速，在传染病防控、流行病学调查、临床快速诊断、病原体基因组学研究等领域，凭借其便于携带、实时测序、超长读长等技术优势，得到广泛应用[2-10]。本文简要介绍了纳米孔测序的原理与特点，阐述了其在国内外兽医实验室的应用现况和前景，以期为动物疫病防控提供新的技术支撑。
1.1 原理
所谓“纳米孔”，是指纳米级蛋白质孔。它作为生物传感器，嵌入到由一组流体芯片微支架支撑的电阻聚合物膜中（图1）。在这张膜上施加恒定电压产生电位差，由控速蛋白驱动单链 DNA 或RNA 分子，使其从带负电的“顺式”侧到带正电的“反式”侧，以一定速度通过纳米孔蛋白。不同的碱基会引发不同的电流变化，信号处理电路实时检测记录电流变化，并运用测序软件对电信号进行解码，这样就实现了对单分子核苷酸序列的实时测序[11-12]。
图1 纳米孔测序原理
1.2 特点
1.2.1 操作简单、便携 和第二代基因测序技术相比，纳米孔测序技术无需扩增，操作流程简化，仪器和耗材便于携带，如MinION、QNome-3841测序仪只有U 盘大小，与笔记本电脑通过USB 口连接即可实时测序（图2）。纳米孔现场测序试剂盒无需冷链保存或运输，文库制备速度快，适合现场诊断动物疫病。
图2 MinION 和QNome-3841 实物
1.2.2 快速实时测序 MinION 的流动池有2 048个纳米孔，每个纳米孔的DNA 测序速度约为450 bp/s；
QNome-3841 有384 个纳米孔，DNA 测序速度为350～450 bp/s。测序开始后，原始信号立刻传输到计算机，产生FASTQ 格式数据并与数据库分析比对，1 min 内实时形成结果。野外环境下无需联网即可测序，特别适用于基础设施不完备的边远边境地区。
1.2.3 超长读长 MinION 的最大读取长度为2.273 Mbp 碱基，平均读取长度约为23 kbp，QNome-3841 的读取长度为200 bp～1 Mbp，从而解决了第二代测序技术难以鉴别串联重复序列等复杂DNA 结构的弊端。这意味着基层兽医实验室仅凭纳米孔测序平台，即可获得高质量全基因组。
1.2.4 准确度高 MinION（R9.4 芯片）和QNome-3841的单碱基序列测序准确度分别为85%～94%和90%。这个准确度固然无法精准表征某个特定碱基的变异，但对兽医实验室来说，足以准确鉴定病原体。
作为具有较高应用价值的先进技术，随着商品化进程加快，纳米孔测序技术可能成为今后兽医实验室的有力手段。
2.1 现场处置新发、突发、外来动物疫情
进入自媒体时代后，突发动物疫情或畜禽不明原因死亡等公共卫生事件，往往快速引发舆情和社会关注，给相关部门带来很大压力。兽医实验室现有的病原分离鉴定、抗原抗体反应、PCR 核酸检测等方法，只能针对已知病原体。面对突发、新发、外来动物疫情，或者辖区内出现不明原因死亡畜禽时，兽医实验室通常立足现有检测技术手段，采用“穷举法”，把所能用到的检测方法都尝试一遍。这很难及时准确鉴别病原体，给出精准检测结果。而基于宏基因组分析的纳米孔测序技术，可弥补对未知病原体诊断能力的缺失，将纳米孔测序与传统检测技术相结合，有助于提高基层有效应对突发、新发、外来动物疫情以及处置公共卫生事件的能力。
2019 年2 月，内蒙古阿尔山市桑都尔林场210 头野猪不明原因死亡。军事兽医研究所闫晓敏等[13]对脾脏样品进行纳米孔测序，10 min 内构建文库，测序 4 min 即获得首批1.25 kb 的序列读数（reads），有效覆盖非洲猪瘟病毒（ASFV）全基因组的特异性序列；
在接到样品后2 h 30 min 内，共检测出213 条序列，覆盖28.1%的ASFV 全基因组，迅速确定本起疫情由ASFV 所致。同年，O"Donnell 等[14]利用“MinION+现场测序试剂盒（SQK-LRK001）”，模拟野外环境对ASF 全血样本进行测序，核酸提取后15 min 即生成文库，7 h 后，解析出 81% 的ASFV 全基因组，总耗时7 h 15 min；
而实验室条件下使用“MinION+快速文库制备试剂盒（SQK-RPB004）”的对照组，核酸提取后2 h 15 min 生成文库，3 h 30 min 内即解析出100%完整的ASFV 全基因组，总耗时5 h 45 min。
2018 年，Hansen 等[15]开发了一种用于口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）血清分型的快速纳米孔测序方法，在常规实验室条件下，分别进行7 种FMDV 血清型的样品制备和RNA 提取，然后使用MinION 直接进行cDNA 测序，在5 h 内，完成了全部7 种FMDV 血清型样品的基因测序及鉴定，总体映射特异性为98.3%。2021 年，Brown 等[16]进一步开发了一种MinION与RT-PCR 联用，快速鉴别临床样品FMDV 血清型的方法；
测序2 min 后，几乎一半（4/9）的样本100%覆盖参考序列；
测序10 min、30 min 和2 h 30 min 后，3 个细胞培养上清液、3 个舌上皮悬浮液和3 个口腔拭子样本，全部100%覆盖参考序列。
2.2 流行病学调查
全基因组测序是当前分子流行病学调查的主流技术。2022 年，郑晶等[17]对圆环病毒 3 型美国毒株，桑淼等[18]对禽网状内皮组织增生症病毒山东SD2101 株，田似报等[19]对猪流行性腹泻病毒山东SD20BZ01 株，进行全基因组测序，这均为病毒遗传变异和流行病学分析以及防控策略的科学制定，提供了重要参考和理论依据。
虽然第二代基因测序技术具备高通量、准确度高、技术路线成熟等优势，但限于实验环境条件，很难用于现场动物疫病诊断，且时效性差。基于扩增子或不依赖序列的单一引物核酸扩增技术（sequence-independent single primer amplification，SISPA）的纳米孔测序技术，将纳米孔测序仪与PCR 联合应用，以快速获得病原体全基因组序列，进而展开分子流行病学调查，这对疫病防控意义重大。
2021 年，Park 等[20]使用qPCR 与MinION，对携带汉坦病毒（Hantaan virus，HTNV）的黑线姬鼠肺组织样品，进行基于扩增子的纳米孔测序，8 h 后，得到同源性为99.8%（L和M片段）和99.7%（S 片段）的HTNV 全基因组序列。同年，Kinimi 等[21]使用基于扩增子的纳米孔测序技术，分别对2016 年和2018 年从坦桑尼亚山羊中收集的小反刍兽疫病毒（PPRV）阳性样本进行测序，4 h内生成了2 个完整的PPRV 全基因组。2021 年2 月，Crossley 等[22]将PCR 与MinION 组合作为快速实验室检测工具，通过基于扩增子的纳米孔测序技术，使用临床样本，对禽流感病毒（AIV）所有8 个基因片段进行测序，从拭子送达实验室到获得完整的全基因组，最快15 h。
2.3 动物疫病监测
对跨边境野生动物和迁徙野禽携带的病原体，特别是未知病原体的检测，目前欠缺合适的技术手段[23-25]。内蒙古有4 200 km 边境线，有呼伦湖、乌梁素海和黄河流域湿地等迁徙野禽栖息地，栖息着大量黄羊、狼、狐狸、草原蜱以及野禽等跨边境野生动物，如何对其有效开展病原体检测，是迫切而现实的问题[26-27]。在“边境地区动物疫病联防联控”机制下，以纳米孔测序为抓手，探索建立灵敏可靠、灵活机动、快速反应的外来病原体监测预警网，是一个值得尝试的课题[28]。
2020 年，Oude 等[29]采用多重纳米孔宏基因组测序技术，确认卡塔尔 Alkharsah 地区被野生狐狸咬伤后死亡的骆驼以及被捕获的狐狸所感染的狂犬病病毒（RABV）序列来自阿拉伯半岛的一个进化支和集群。同年，McCuen 等[30]结合雷达遥感和切向流超滤技术，通过基于扩增子的多重纳米孔测序，对加利福尼亚州两个高水禽密度湿地的水样、土壤和候鸟粪便样品进行禽流感病毒（AIV）检测，检出来自26 个鸟类宿主的4 种AIV 亚型。2021 年，Sarchese 等[31]通过基于SISPA 的纳米孔测序技术，从1 只死亡野狼的粪便样本中，鉴定表征了1 株基因3 型戊型肝炎病毒（HEV-3）的全基因组。同年，Brinkmann 等[32]采用基于SISPA 的纳米孔测序技术，表征了蜱标本和培养蜱携带的克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever Virus，CCHFV）宏基因组。
2.4 动物疫病临床诊断
对畜禽群发性疫病的快速诊断，是动物疫病预警体系的重要组成部分。使用纳米孔测序技术，2016 年Vanmechelen 等[33]在长颈鹿的疣中鉴定出一种新型乳头瘤病毒，2017 年Günther 等[34]获得了从灰海豹中分离出的副痘病毒全基因组，2019 年Wongsurawat 等[35]检测出委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）。在猪病临床诊断领域，已有多种新病毒，如科布病毒（kobu viruses）、正呼肠孤病毒（orthoreovirus）、猪星状病毒（porcine astrovirus，PAstV）、肠道病毒（enteroviruses）、环状 DNA 病毒（circular DNA viruses）、沙波病毒（sapporo virus）、博卡病毒（bocavirus）、皮可比那病毒（picobirnaviruses）、猪捷申病毒（porcine teschovirus）[36-42]等，通过病毒宏基因组学得到准确鉴定。
2018 年，Theuns 等[43]将细胞培养的猪流行性腹泻病毒（PEDV）和轮状病毒A（RVA）汇集后进行纳米孔测序，测序7 s 和24 s 后，分别生成了匹配PEDV 和RVA 的第一个读数；
PEDV 测序1 h内获得高测序深度（43.0×），11 个RVA 基因片段在3 h 内获得高测序深度（19.2～48.2×）；
对1周龄仔猪的腹泻粪便样本测序，使用BLASTn算法，在26 s 内准确鉴别出猪科布病毒（18～22 个读数）、肠道病毒G（5～9 个读数）和星状病毒（4 个读数）。同年2 月，Mccabe 等[44]将3 种新用于生产牛呼吸道疾病（BRD）改性活疫苗（MLV）的牛呼吸道病毒——合胞病毒（BRSV，RNA 病毒）、牛疱疹病毒1 型（BoHV1，DNA 病毒）和牛副流感病毒3 型（BPI-3，RNA 病毒）的胎儿肺细胞培养物合并，采用MinION 测序运行16 h，生成并分析了7 000 多个测序读数，其中2 937 个读数被确定为病毒（2 926 个被识别为 BRSV、BoHV1 和BPI-3）。
近年来，已有企业把纳米孔测序技术成功用于兽医临床[45]。纳米孔测序技术在保障畜牧业生产的同时，也为动物疫病预警开辟了一条新技术途径。
2.5 病原体基因库建立
完善农业微生物等生物种质资源基因库，是《“十四五”全国农业农村科技发展规划》提出的目标[46]。动物疫病病原体是农业微生物的一个重要门类，按照时间线和空间横断面，有计划、有步骤地建立病原体基因库，不但可为今后的分子流行病学调查打下牢固根基，还可以根据耐药和毒力基因的变化，预判病原体的耐药和预后情况，科学调整防控措施。
乌干达牛走廊（the Ugandan cattle corridor，UCC）是自乌干达Mbarara 延伸至其边境的一片形似走廊的地理区域，养殖的牛只总数占全国的45%。2018 年，Pullen 等[47]利用纳米孔测序技术开展人-动物界面的结核病横断面监测，建立了UCC 牛型结核分枝杆菌（Mbv）基因库；
通过与医疗中心合作取得结核病人痰液样本，与屠宰场合作取得肉牛血液和淋巴结样本，利用基因水平的系统发育分析方法，明确了Mbv 在此区域的传播规律；
通过对Mbv 毒力和耐药基因的跟踪性比对分析，取得了具有临床意义的耐药性分析结论和用药指导建议。
2021 年，Bolotin 等[48]使用MinION，对1974年从乌克兰卢甘斯克地区羊流产胎儿中分离出的布鲁氏菌菌株进行全基因组测序，运行48 h 后，得到两条共3 281 317 bp 的环状染色体，PATRIC完整性评分100%，基因组包含55 个tRNA、9 个rRNA 和3 329 个DNA 编码序列，34 个抗生素抗性基因（耐药因子）和228 个毒力因子，证明了纳米孔测序平台具有独立建立布鲁氏菌基因库的能力。2022 年，Craddock 等[49]基于第二代测序Illumina 和纳米孔测序MinION 混合平台，对来自以色列南部的18 个布鲁氏菌分离株进行测序并把数据混合组装，得到了“最全面”的布鲁氏菌基因库数据。
作为分子生物学和 IT 技术高度融合的产物，纳米孔测序技术在简化操作流程的同时，也增强了对计算机分析软件和硬件算力的依赖。2020 年，Harris 等[50]对纳米孔测序技术在美国农业部国家动物健康实验室网络（NAHLN）的应用进行了总结，发现NAHLN 技术人员对基因测序分析软件和计算机硬件的满意率只有53%～63%。开发一系列易于操作、用户友好、贴近实务的界面分析软件，以弥补兽医实验室技术人员生物信息数据分析能力的普遍欠缺与不足，对纳米孔测序技术在动物疫病防控中的大规模应用具有决定性作用。
21 世纪以来，PCR 核酸检测技术已经在我国各级兽医实验室逐步落地并成为主流。从技术特点分析比较，纳米孔测序技术在宏基因组分析和全基因组研究方面，具有PCR 无可比拟的技术优势。将纳米孔测序技术稳步纳入兽医实验室能力建设体系，可在检测灵敏度、准确度、分辨率，以及稳定性、可靠性、时效性等多个维度，有效提升各级兽医实验室的技术支撑能力，有助于更好地服务于动物疫病防控大局。2017 年，我国疾病预防控制系统建立了国家致病菌识别网。时至今日，基因测序已经成为疾病控制系统（国家、省、市、县四级）实验室传染病监测和分子流行病学调查的常规工具[51-52]。
随着纳米孔测序技术的不断发展，其测序通量、准确度和自动化程度有望进一步提高，测序成本和时间周期有望进一步下降，生物信息数据分析软件的丰富性和易用性有望进一步改善。展望未来，纳米孔测序技术在动物疫病防控中的应用潜力巨大，将在实践中得到更好地发挥与证明。
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