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唐亮，唐名艳，潘志新，蒋满贵，赵烨芸，余武昌，李标，虞崇江，董桂清*
（1.广西壮族自治区蚕业技术推广站，南宁市 530007；
2.广西壮族自治区蚕业科学研究院，南宁市 530007）
广西是全国蚕桑产业大省（区），在承接“东桑西移”的产业转移中，逐渐形成了以小蚕共育及多批次连续养蚕为特点的广西高密度养蚕模式，为蚕茧产量提升提供了有力保障，使广西成为了全国乃至世界重要的桑蚕茧丝生产基地。但广西高温多湿气候以及连续养蚕的饲养模式，更易多发生物病原繁殖与感染从而引发病害。据不完全统计，广西蚕桑生产中由发生蚕病造成的蚕茧损失15%～20%。
家蚕血液型脓病又称家蚕核型多角体病（Bombyx moriNuclearpolyhedrosis Virus NPV，简称BmNPV），是危害家蚕最严重的一种病毒病，仅2008—2018 年广西家蚕脓病年均发生率为11.35%，使之成为广西最为严重的传染性蚕病之一［1-2］，每年损失蚕茧达数万吨。其病毒是一种有包涵体的DNA 病毒［3］，对蚕座血液型脓病次生感染进行调查情况，有助于解析家蚕病毒病传播的关键要素，服务蚕桑产业蚕病防控。基于家蚕血液型脓病对蚕桑产业的巨大危害，精准防控该病成为国内外学者研究的热点和难点。王霞等［4］通过对广西不同蚕区来源的15 株BmNPV毒株进行测定，其对家蚕品种两广二号的LC50多角体浓度2.1×106～4.2×106个/mL，属于抗性较高水平，但毒株间差异不显著。在前期蚕病普查研究中发现，广西河池地区血液型脓病的发病率与季节、蚕区有紧密的相关性，如夏季的6—8 月血液型脓病显著高于其他月份；
气温高和降雨多的蚕区血液型脓病年均发生率高，如贵港蚕区夏季发病率为18.15%，危害严重［2］。
偏相关分析是指当两个变量同时与第三个变量相关时，将第三个变量的影响剔除，只分析另外两个变量之间相关程度的过程，判定指标是相关系数的R值，是目前使用较多的一种分析工具。影响家蚕血液型脓病的因子较多，对传染因子进行偏相关分析可以实现精准防控该病，抓住主要影响因子。韦秉兴等［5］2008 年报道将5%BmNPV 的两广二号病蚕混入不同饲养密度的5龄蚕群体，观察脓病二次感染的发生率。结果显示，909 头/m2的饲养密度脓病发病率高达68.40%，但其试验设计中，传染因子种类设置较少，在蚕座传染试验设计上，混育群体数量较少，数据处理采用回归统计分析，未进行偏相关分析。而在丝茧育养蚕过程中，养蚕群体较大，传染影响因子较多，气候、饲育密度、混育病蚕数等对发病率可能有较大影响。
血液型脓病的高发生率通常被认为是病蚕在蚕座中发生了二次感染导致（也称次生传染），但低龄蚕期感染病原形成的次生传染规律及防控措施有效性等鲜有报道。小蚕共育是广西蚕桑生产中常见的饲育形式，将蚕儿共育至3龄饷食后售卖，3龄第二口叶转由农户饲养。如共育的小蚕存在血液型脓病感染，那么脓病感染率对大蚕饲养产生何种影响尚未可知。基于以上问题，本研究对不同气候条件、饲养密度、病蚕比例、药物处理等血液型脓病传染因子进行调查分析，为防控家蚕血液型脓病提供理论依据。
1.1 试验材料
测试病原来源于广西河池蚕区，从发病脓蚕中分离制备多角体病毒，4.0 ℃保存备用。供试家蚕品种为两广二号。混入病原蚕的制备方法：分别在混入病蚕前84 h、96 h、108 h 在桑叶上涂抹浓度为5×108个/mL 病毒多角体并连续添食，在同期两广二号正常蚕起蚕第二口叶时，挑选出有典型脓病症状的病蚕（比如在蚕座中表现狂躁、体色乳白、高节、乱爬的蚕），用马克笔标记，作为测试混入源病蚕。Tris、NaCl、EDTA、SDS、TritonX 等试剂为沪试，家蚕核型多角体（RAA）快速检测试剂盒由广西壮族自治区蚕业技术推广站及南宁众测有限公司联合研发。
1.2 不同饲养气候环境混入不同比例病蚕条件下家蚕血液型脓病蚕座内次生传染率测定
在实验室模拟广西蚕区春、夏、秋季的温湿度气候环境，设置春季（25℃和85%RH）、夏季（33℃和90%RH）、秋季（30℃和80%RH）3 个处理，设空白对照组，每个处理100头（供试健康蚕+混入病蚕=100），每个处理3 个重复。在三龄起蚕第二口叶各个处理分别混入3%、5%、10%等不同比例的病蚕，混入病蚕30 min后正常喂叶，然后按饲养标准饲养至上蔟，调查蚕期病死蚕、上蔟后第5 d（化蛹后2 d）死笼率情况。病死蚕核定采用常规镜检复核和重组酶介导链（RAA 法）复核相结合的方式，精准确定血液型脓病次生传染病蚕数量。
1.3 不同饲养密度环境混入不同比例病蚕条件下蚕座内家蚕血液型脓病次生传染率测定
在实验室模拟低密度、标准密度、高密度3 个不同饲养密度，在标准密度基础上降低33.3%为低密度，在标准密度基础上提高33.3%即为高密度。根据地方标准推荐密度作为标准密度，3～5龄3个龄期饲养密度分别定为8 000 头/m2、3 500 头/m2、750 头/m2，在各龄起蚕第二口叶后设定为各龄间密度转换节点。
设低密度、标准密度、高密度3个处理，设空白对照组。在三龄起蚕第二口叶各个处理分别混入3%、5%、10%等不同比例的病蚕，按照设定密度条件饲养至上蔟，试验设计和调查方法参照1.2执行。
1.4 不同龄期混入不同比例病蚕条件下蚕座内群体家蚕血液型脓病次生传染发病率测定
设3 龄混入病蚕、4 龄混入病蚕、5 龄混入病蚕3个处理，设空白对照组。3 龄期起蚕第二口按3%、5%、10%比例的混入病蚕。试验设计、饲养和调查方法参照1.2执行。
1.5 混入不同比例病蚕条件下用不同药物处理对家蚕血液型脓病蚕座内次生传染率测定
在实验室模拟的秋季环境及标准密度条件下，设置新鲜石灰粉、“蚕康1 号”、风化石灰粉3 个药物处理及阳性和空白对照组。每个处理100头（供试健康蚕+混入病蚕=100），每个处理3个重复。在三龄起蚕第二口叶各个处理区分别混入3%、5%、10%等不同比例的病蚕，分别用新鲜石灰粉、蚕康1号、风化石灰粉等3种药物进行蚕体蚕座消毒，每天喂蚕前分别进行蚕体蚕座消毒1次直至上蔟，阳性对照混入病蚕后不用药物处理。饲养和调查方法参照1.2执行。
新鲜石灰粉制备：块状生石灰与水混合质量比约为1.0∶0.8，放置自然冷却后，将石灰粉过筛密封备用。
自然风化石灰制备：将生石灰暴露于在空气中，待形成松散的白色粉末，收集备用。
1.6 家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染复核
1.6.1 BmNPV镜检复核 将血液型脓病典型症状死蚕，加入等质量的蒸馏水，用小型匀浆器匀浆，吸取少量匀浆液至载玻片上，用2倍检测液体积的50%乙醇处理1 min，制成样品，16×40 倍光学显微镜观察，发现病毒多角体，则记录为病毒再感染蚕体。否则采用RAA 快速检测试剂盒（杭州众测生物科技有限公司）进行检查复核。
1.6.2 BmNPV 的RAA 快速检测复核 将未见血液型脓病典型症状死蚕，取病死蚕匀浆（方法同1.6.1），加入检测液3 倍体积的裂解液（100 mM Tris-HCl pH 8.0，10 mM EDTA pH 8.0，2.0 M NaCl，0.1 M Na2CO3，1%SDS，0.1 mg/mL RnaseA），振荡混匀，常温孵育5～8 min 释放DNA，吸取上清液待用，作为RAA核酸检测的DNA样本。
按照家蚕血液型脓病核酸测试剂盒（RAA 荧光法）使用说明进行测试。每次测试分别用目标基因DNA质粒和蒸馏水设置阳性对照与阴性对照。
1.7 数据矫正与分析
对测定所得数据采用SPSS 25.0 的“单因素ANOVA 检验”进行显著性分析，“偏相关”进行因子相关性分析。
2.1 不同气候环境混入不同比例病蚕蚕座内次生传染发病情况分析
在不同温湿度（模拟不同季节）饲养环境混入不同比例病蚕，蚕期及蛹期第5天血液型脓病发生结果（图1）。混入3%的病蚕，蚕期发病率为春季22.68%＜秋季29.55%＜夏季40.20%，差异达到极显著水平；
蛹期血液型脓病发病率也呈春季（25℃和85%）10.65%＜秋季（30℃和80%）13.75%＜夏季18.90%趋势，发病率随温湿度升高而增大，其中夏季与春季、秋季的差异均达到显著水平。混入5%、10%的病蚕发病率也呈现同样趋势。预示着在蚕群体中已有个体被感染情况下，高温多湿环境是诱导和加快蚕座内次生传染发病的重要因子，与实际生产中6—8月家蚕血液型脓病率高相吻合。
从图1 还可看出，秋季混入3%、5%、10%不同比例病蚕时，蚕期蚕座内次生发病率分别为29.55%、45.96%、63.33%，差异达显著水平；
蛹期发病率也分别达13.75%、19.65%、19.63%。春季、夏季混入不同比例病蚕发病率也有类似趋势，表明家蚕血液型脓病呈现很强的蚕座内群体次生传染力，混入感染病蚕个体比例越高，蚕期及蛹期次生传染发病越严重。因此，家蚕血液脓病防控应重视减少源头病原的感染与防控。
图1 不同气候环境混入不同比例的蚕座内血液型脓病次生传染率
2.2 不同饲养密度混入不同比例病蚕蚕座内群体次生传染发病情况分析
家蚕不同饲养密度混入不同比例病蚕，蚕期及蛹期第5 天血液型脓病发生结果见（图2）。混入3%的病蚕，蚕期发病率呈现低密度25.09%＜标准密度29.21%＜高密度35.40%趋势，高密度与标准密度、低密度差异达到显著水平；
标准密度发病率虽然高于低密度，但未达到显著水平。蛹期发病率也呈低密度9.28%＜标准密度12.37%＜高密度15.12%趋势，发病率随密度升高而增加，但差异不显著。混入5%、10%病蚕发病率也呈现类似趋势。该结果表明家蚕血液型脓病蚕座内群体次生传染发病与蚕座密度有密切关系，蚕座密度越大，次生传染发病率越高，推测原因是因为蚕头密度过高，家蚕食下病毒污染叶的机会较大，还有蚕胸、腹足勾爪相互抓伤，增加病毒创伤感染的机率，同时蚕头密度过高增加健康蚕与病蚕接触的概率，增加传染风险。
从图2还可看出，低密度（标准密度降低33.3%）混入3%、5%、10%不同比例病蚕时，蚕期蚕座内次生传染发病率分别为25.09%、38.60%、54.07%，差异达显著水平；
蛹期发病率也分别达9.28%、12.98%、14.07%，混入10%病蚕与混入3%病蚕的差异达到显著水平。标准密度、高密度混入不同比例病蚕其发病率也呈现类似趋势。该结果进一步表明家蚕血液型脓病呈现很强的蚕座传染，混入感染病蚕个体越多，蚕期及蛹期次生传染发病越严重。
图2 不同饲养密度混入不同比例病蚕蚕座中血液型脓病次生传染率
2.3 不同龄期混入不同比例病蚕蚕座内群体次生传染发病情况分析
不同龄期混入不同比例病蚕，蚕期及蛹期第5 d血液型脓病发生结果见图3。混入3%的病蚕，蚕期发病率呈现5 龄（11.00%）＜4 龄（18.90%）＜3 龄29.55%趋势，差异达到显著水平；
蛹期发病率5 龄（4.47%）＜4龄（11.00%）＜3龄（13.75%），其中3龄混入与5 龄混入的发病率差异达到显著水平。混入5%、10%的病蚕其发病率也呈现类似趋势。预示着家蚕血液型脓病蚕座内群体次生传染发病与蚕被感染龄期有密切关系，被感染龄期越小，次生传染发病率越高。
从图3 还可看出，3 龄期混入3%、5%、10%病蚕时，蚕期蚕座内次生发病率分别为29.55%、45.96%、63.33%，差异达显著水平；
蛹期发病率也分别达13.75%、16.49%、19.63%，其中混入10%病蚕与混入3%病蚕其发病率差异达显著水平。4龄期、5龄期混入不同比例病蚕其发病率也有类似趋势。该结果进一步表明家蚕血液型脓病呈现很强的蚕座内群体次生传染发病，只要有传染源存在，就会形成传播链，迅速传播感染，蚕龄期越小，次生传染发病率越高。
图3 不同龄期混入不同比例病蚕蚕座中血液型脓病累计发生曲线
2.4 混入不同比例病蚕后不同药物处理对蚕座内群体次生传染发病情况分析
不同药物处理蚕期及蛹期第5 d 血液型脓病防控效果结果见图4。在3 龄混入病蚕后，不同药物处理的防控效果表现为新鲜石灰粉80.24%＞“蚕康1号”67.44%＞自然风化石灰粉41.86%，差异达显著水平。4龄、5龄混入病蚕后，不同药物处理也呈现类似趋势。该结果表明防控药物介入可降低次生传染发病率，但不同药物防控效果不一样，如本试验中新鲜石灰粉和“蚕康1 号”两种药物均能显著降低血液型脓病发病率。
从图4 还可看出，新鲜石灰粉防控效果，呈现混入3%病蚕（80.24%）＞混入5%病蚕（51.91%）＞混入10%病蚕（49.12%）的趋势，差异达到显著水平。“蚕康1 号”、风化石灰粉防控效果也呈现类似趋势。该结果表明随着蚕群体内被感染病蚕个体增加，形成多点不同时期发病的多条传播链，如果每天只施用1次的药物处理，难以有效切断传播链。因此，在生产上发现血液型脓病感染发病后，应注意观察蚕的发育情况，及时捡出病死蚕并增加施用药物次数，以提升防控效果。
图4 不同病蚕混入、不同药物处理的蚕座血液型脓病防控效果曲线
2.5 各影响因子与群体中血液型脓病次生传染发病的偏相关分析
利用SPSS 25.0 对各测试因素进行偏相关分析，获得的数据显示（表1），相关性最高的为“病蚕比例”，为0.603，其次是“混入龄期（时长）”，为0.393，第三是“药物处理”，为-0.381，之后是“饲养季节”，为0.232和“饲养密度”，为0.221。即影响家蚕群体血液型脓病次生感染的首要因素是病蚕混入比例，其次是起始感染龄期，第三是药物处理。其中前两者显著正相关，而药物处理呈显著负相关。
表1 不同因子与家蚕群体血液型脓病发病率的偏相关分析
本研究通过蚕座中病血液型脓病次生感染情况，探究不同因子对家蚕“两广二号”发病情况的影响，明确该病在蚕座中的传染规律。
在不同气候（模拟不同季节），混入同一比例的病蚕，蚕座内次生传染发病率呈现春季＜秋季＜夏季的趋势，差异达到极显著水平，在蚕群体内已有个体被感染情况下，高温多湿环境是诱导和加快蚕座内次生传染发病的主要因子，在生产上也得到了证实［2，4，6］。
在同一气候环境下，蚕座内次生传染发病率呈现混入病蚕比例越高发病率越高的趋势，差异达显著水平。表明家蚕血液型脓病呈现很强的蚕座内群体次生传染力，混入感染病蚕个体比例越高，次生传染发病越严重，偏相关分析其与发病率的相关系数最高，表明控制病蚕数量应是血液型脓病早期防控中最重要的环节。
不同饲养密度饲养条件下，混入同一比例的病蚕，蚕座内次生传染发病率呈现低密度＜标准密度＜高密度的趋势，高密度与标准密度和低密度差异达到显著水平，但相关系数在所测影响因子中排名最后。表明家蚕血液型脓病蚕座内群体传染与蚕座密度有一定关系，过密的蚕座使血液型脓病传染发病率更加严重，生产上也存在这种趋势［5，7］。
不同龄期混入病蚕的试验中，蚕座内次生传染发病率呈现出5 龄＜4 龄＜3 龄的趋势，差异达显著水平，且偏相关性分析显示相关系数仅次于病蚕混育率。表明家蚕群体血液型脓病次生传染发病率与被感染龄期有密切关系，龄期越大发病越少，表明蚕病防控中应重视小蚕期的病原清除与隔离，以降低血液型脓病危害。
不同药物对病蚕混育率的防控效果有差异，防控效果新鲜石灰粉＞蚕康1号＞自然风化石灰粉，偏相关分析差异达显著水平，表明防控药物介入可降低次生传染发病率，但不同药物防控效果不一样，如本试验中新鲜石灰粉和蚕康1 号两种药物均能显著降低血液型脓病发病率［8］。
在相同药物处理条件下，随着初始混入病蚕比例增加，防控效果呈现下降的趋势，偏相关分析差异达到显著水平，表明随着蚕群体内被感染病蚕个体比例增加，多点散发不同时期发病的多条传播链，如果每天只施用1次药物，很难完全有效切断所有传播链，会出现病原“逃逸”现象，增加扩散传染的风险，所以在药物防治上，增加施用次数能够减轻危害。
通过对广西地区“两广二号”血液型脓病传染因子进行研究并且首次采用偏相关分析，认为，蚕群体内有病蚕，高温多湿环境是诱导和加快蚕座内次生传染发病的主要因子；
家蚕血液型脓病呈现很强的蚕座内群体次生传染力，群体中病蚕比例越高，蚕座传染越严重；
蚕座密度越高，次生传染发病率随之提升；
家蚕群体血液型脓病次生传染发病率与被感染龄期有密切关系。偏相关分析结果显示，病蚕混育率是最主要的影响因子，其次是混育龄期，第三是使用药物，第四是饲养季节，最后是饲养密度。每天施用一次药物仍然会出现病原逃逸的现象，宜增加施药次数减轻危害。
