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郝婧雯 邓炎尧 谢君 万奇
长沙市第一医院神经内科（长沙 410000）
阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD）是一种以进行性记忆丧失和认知障碍为特征的神经退行性疾病，其特征是Tau 聚集体在大脑中沉积和认知缺陷［1-2］。细胞内过度磷酸化的Tau 蛋白是神经原纤维缠结的关键成分，导致神经元微管结构异常和轴突运输功能障碍［3］。因此，通过上游靶信号的早期修饰治疗抑制Tau 过度磷酸化可能是在预防AD 方面最有效的途径。新出现的证据表明，microRNAs（miRNAs）参与AD 中的多个病理过程［4-5］。据推测，miRNA 靶向网络的异常调节通过调节涉及Aβ 过度产生的基因、Tau 过度磷酸化、神经胶质激活诱导的神经炎症、突触功能障碍、和神经元凋亡在AD 病理过程中起关键作用［6-8］。microRNA-9-5p（miR-9-5p）可以抑制神经系统的细胞损伤。例如，miR-9-5p 通过靶向GSK-3β 抑制AD 细胞模型中的线粒体损伤和氧化应激［9］。然而，目前尚不清楚miR-9-5p 是否对AD中Tau 过度磷酸化产生影响。因此，本研究选择APP/PS 小鼠模型作为研究对象，并分析miR-9-5p在小鼠海马和血浆中表达情况，同时使用慢病毒（lentivirus，Lv）介导海马中miR-9-5p 过度表达，并针对认知行为、突触活动、Tau 磷酸化和DNA 损伤进行了表征。
1.1 动物分组和处理雄性APPswe/PS1dE9（APP/PS1）转基因小鼠和WT C57BL/6（WT）同窝小鼠获自南京大学模型动物研究中心。将APP/PS1 小鼠随机分为3 组：Lv-WT 组、Lv-con 组和Lv-miR-9-5p组，每组18 只；
WT 小鼠各随机分为3 组：Lv-WT组、Lv-con 组和Lv-miR-9-5p 组，每组18 只。过表达miR-9-5p（Lv-miR-9-5p）和对照（Lv-con）的Lv 购自上海吉凯基因化学技术公司。将Lv-miR-9-5p（4×105转导单位［TU］）或Lv-con（4×105TU）缓慢注射到6 个月大的APP/PS1 小鼠（Lv-miR-9-5p 组和Lv-con 组）的双侧海马中（前后位置-2.0 mm，内侧-外侧位置±1.6 mm，背腹距前囟1.5 mm）。同时，将Lv-con（4 × 105TU）缓慢注射到6 个月大的WT 小鼠（Lv-WT 组）的双侧海马中。注射后30 d进行行为测试或电生理实验，然后处死小鼠进行其他实验。
1.2 行为测试参照文献方法［10］进行新物体识别（novel-object recognition，NOR）、恐惧状态（fear condition，FC）和莫里斯水迷宫（Morris water maze，MWM）测试。（1）NOR：在NOR 试验前24 h，将小鼠适应在一个30 cm 长×30 cm 宽×45 cm 高的非透明盒子中30 min。在训练阶段，向小鼠展示两个新对象（对象1 和对象2），并允许其自由探索10 min。在测试阶段，将其中一个对象（对象2）替换为一个新对象。让小鼠探索这两个物体5 min。使用视觉跟踪系统记录探索过程，并通过探索新物体的时间除以总时间计算辨别指数。（2）恐惧状态测试：使用XR-XC404 条件反射室（上海欣软信息科技有限公司）进行情境和线索恐惧条件测试。在训练阶段，将小鼠置于室内3 min，然后进行声调电击刺激，并在刺激后继续在室内停留30 s。在试验阶段，在训练后24 h 测量环境依赖性试验，并允许小鼠在同一室内停留5 min。停止被定义为“除呼吸外无运动”，并使用跟踪系统记录停止时间。2 h 后，这些小鼠被带到一个完全不同的新房间，持续3 min，并传递训练音调，以检查提示性恐惧条件反射。（3）MWM：进行MWM 测试以评估空间记忆功能。在采集试验期间，小鼠在60 s 内接受连续5 d 的训练，以找到隐藏在水下1 cm 处的平台，并使用迷宫软件记录潜伏期（美国Stoelting公司）。在探针试验期间，移除平台，让小鼠游泳1 min。然后记录穿过平台的次数、找到目标象限的潜伏期、在目标象限花费的时间、游泳速度和总距离。
1.3 微阵列和定量实时PCR分离海马组织并使用组织匀浆器（武汉赛维尔生物科技有限公司）进行匀浆，使用RNeasy Mini Kit（德国QIAGEN 公司）或MiRNeasy Serum/Plasma Kit（德国QIAGEN 公司）提取和纯化组织或血浆中的RNA。使用具有1 881 个独特miRNA 探针的小鼠miRNA 微阵列（Release 21.0；
数谱（上海）生物科技有限公司）分析miRNA 表达谱。筛选出APP/PS1 小鼠海马中差异表达的miRNA（倍数变化＞2，调整P＜0.05）。使用TaqMan Advanced miRNA Assays（美国Thermo Fisher 公司）对miR-9-5p 表达进行定量。使用ABI 7500 PCR 仪器（美国Applied Biosystems 公司）进行反应。U6 小核RNA（snRNA）和cel-miR-39（美国Thermo Fisher 公司）分别用作组织和血浆的对照。用于实时PCR 的引物序列如下：miR-9-5p 正向：5"-GGGGTAGCACCATTTGAAA-3"，反向：5"-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3"；
U6 正向：5"-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3"，反向：5"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3"。
1.4 电生理学参照文献方法［11］制备海马切片（300 μm）。将切片转移至微电极阵列，连续灌注含氧人工脑脊液（ACSF）（2 mL/min），并保持在32 ℃进行记录。使用MEA-2100-60-System（德国Multi Channel Systems 公司）记录CA1 辐射层中的场兴奋性突触后电位（excitatory postsynaptic potentials，EPSP）。为了评估突触的输入输出关系，研究测量了EPSP 的斜率。刺激强度是长时程增强（long-term potentiation，LTP）实验中最大诱发反应的一半。LTP 由高频刺激（HFS；
100 Hz，三列，1 s持续时间，10 s 间隔时间）诱导。初始EPSP 斜率由控制期间的平均斜率值标准化。通过LTP-Director软件获取数据，并使用LTP-Analyzer 软件进行数据分析。
1.5 高尔基染色根据快速高尔基染色试剂盒（美国FD Neurotechnologies 公司）进行高尔基染色。将小鼠的脑组织在室温避光下在溶液A 和B的混合物中浸泡2 周，然后转移到溶液C 中6 d。用低温切片机（德国Leica 公司）将脑组织切成100 μm 切片，并使用X73 倒置显微镜（日本Olympus 公司）捕获图像。计算CA1 区每10 μm 突触长度的二级突触分支刺数和每10 μm 蘑菇刺的百分比。
1.6 蛋白质印迹分析将海马组织（每组n= 6）置于玻璃匀浆器中在1∶107（w/v）冰冷的蛋白质提取缓冲液中匀浆。收集可溶性蛋白，4 ℃12 000g离心10 min，通过SDS-PAGE 分离蛋白质并转移到PVDF 膜上。将膜在5%脱脂牛奶中封闭2 h，并在4 ℃下与以下一抗孵育过夜：抗AT8（1∶1 000；
美国Chemicon 公司）和抗GAPDH（1∶5 000，美国Bioworld 公司）。用0.1% Tween 20/Tris 缓冲盐水洗涤30 min 后，将膜与二抗在室温下孵育2 h。使用ECL 试剂盒（美国Millipore 公司）可视化蛋白质信号，并使用Image J 软件量化强度。
1.7 免疫荧光分析将脑组织（n= 6）固定72 h，然后由石蜡块制成6 μm 厚的冠状切片，或25 μm厚的冰冻切片（前囟后-1.46 ～-2.46 mm）。用0.01 mol/L 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）在90 ℃进行抗原修复15 min 后，用10%正常山羊血清阻断非特异性结合。然后在4 ℃下应用特定的一抗孵育过夜：AT8、γH2AX（美国Chemicon 公司）。然后将切片与特异性Alexa Fluor 568 或488 二抗（美国Invitrogen 公司）在室温下孵育2 h。用3 μmol/L 4"-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美国Sigma-Aldrich 公司）进行复染。在配备ZEN light 软件的LSM 700激光扫描共聚焦荧光显微镜（德国Carl Zeiss 公司）下观察免疫标记的组织。所有定量分析均在至少四个图像上进行，这些图像是从至少三个独立实验中每只动物至少四个连续切片获得。
1.8 统计学方法所有数据均使用SPSS 18.0 软件进行分析。计量资料表示为均值±标准差，组间比较用t检验；
多组比较用重复测量的单因素或双向方差分析，后进行Bonferroni 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 APP/PS1 小鼠的海马和血浆中miR-9-5p 降低与年龄匹配的野生型（WT）同窝小鼠相比，6 个月大的APP/PS1 小鼠海马中有17 个miRNA 上调和47 个miRNA 下调（图1A）。6月龄和9月龄APP/PS1 小鼠海马中miR-9-5p 水平较WT 组显著降低（图1B）。此外，6 个月大的AD 小鼠血浆中miR-9-5p 水平降低（图1C）。
图1 APP/PS1 小鼠的大脑和血浆中的miR-9-5p 减少Fig.1 Decreased miR-9-5p in brain and plasma of APP/PS1 mice
2.2 外源性miR-9-5p 过表达可防止APP/PS1 小鼠的记忆和突触损伤Lv-miR-9-5p 处理后，海马和血浆中miR-9-5p的水平显著升高（图2）。为了研究miR-9-5p 过表达对APP/PS1 小鼠记忆功能的影响，在Lv 注射后30 d 进行了行为测试，包括新物体识别、恐惧条件和莫里斯水迷宫测试。与Lv-con组小鼠相比，Lv-miR-9-5p 组小鼠的辨别指数、关联条件恐惧停止、暗示条件恐惧停止、跨平台次数和目标象限时间均显著增加（P＜0.05），和跨平台时间显著降低（P＜0.05），见表1。
图2 在6 个月大的APP/PS1 小鼠的海马中过表达外源性miR-9-5p 后海马和血浆中miR-9-5p 水平Fig.2 Levels of miR-9-5p in hippocampus and plasma after overexpression of exogenous miR-9-5p in the hippocampus of 6-month-old APP/PS1 mice
表1 外源性miR-9-5p 过表达对APP/PS1 小鼠记忆损伤的影响Tab.1 Effect of exogenous miR-9-5p overexpression on memory impairment in APP/PS1 mice±s
表1 外源性miR-9-5p 过表达对APP/PS1 小鼠记忆损伤的影响Tab.1 Effect of exogenous miR-9-5p overexpression on memory impairment in APP/PS1 mice±s
注：与Lv-WT 组相比，**P ＜0.01，***P ＜0.001；
与Lv-con 组相比，#P ＜0.05，###P ＜0.001
组别Lv-WT Lv-con Lv-miR-9-5p F 值P 值NOR 测试辨别指数0.73±0.08 0.58±0.06**0.75±0.05##4.216 0.038条件性恐惧测试关联条件恐惧停止（%）78.26±4.21 54.32±3.77***75.49±3.58###5.136 0.015 MWM 测试跨平台时间（s）6.74±0.45 15.26±1.83***10.44±0.79#8.564＜0.001暗示条件恐惧停止（%）74.82±4.06 49.13±3.41***75.63±3.85###5.287 0.013跨平台次数3.88±0.48 1.63±0.24***2.84±0.28#7.842＜0.001目标象限时间（s）23.10±2.56 16.42±1.04***19.63±1.27#7.193＜0.001
2.3 外源性miR-9-5p 过表达可防止APP/PS1 小鼠的突触损伤与Lv-con 组相比，Lv-miR-9-5p 组小鼠海马中的突触棘密度、蘑菇刺的百分比显著增加（P＜0.05，图3A-C），并且Lv-miR-9-5p 组小鼠表现出更高的长期增强幅度（图3D）。
图3 外源性miR-9-5p 过表达可防止APP/PS1 小鼠的突触损伤Fig.3 Exogenous miR-9-5p overexpression prevents synaptic damage in APP/PS1 mice
2.4 外源性miR-9-5p 过表达可防止Tau 过度磷酸化免疫印迹和免疫荧光分析共同显示，与Lv-WT组相比，Lv-con 组小鼠海马中AT8（Ser202/Thr205）水平显著升高（P＜0.05）。而Lv-miR-9-5p 组小鼠海马中AT8（Ser202/Thr205）水平较Lv-con 组显著降低（P＜0.05），见图4。
图4 小鼠海马中AT8 蛋白的免疫印迹和免疫荧光分析Fig.4 Immunoblot and immunofluorescence analysis of AT8 protein in mouse hippocampus
2.5 外源性miR-9-5p 过表达可防止Tau 过度磷酸化诱导的DNA 损伤海马中Tau 过度磷酸化是疾病过程的标志，可能代表DNA 损伤。与Lv-WT组相比，Lv-con 组小鼠海马中AT8 和γH2AX 共定位数量显著升高（P＜0.05）。而Lv-miR-9-5p 组小鼠海马中AT8 和γH2AX 共定位数量较Lv-con 组显著降低（P＜0.05），见图5。
图5 小鼠海马中AT8 和γH2AX 的免疫荧光染色代表图和定量分析Fig.5 Representative images and quantitative analysis of immunofluorescence staining for AT8 and γH2AX in the mouse hippocampus
AD 的病因复杂，迄今为止，常规的药物治疗只能适当缓解AD 患者的某些症状，不可避免地会产生相应的副作用［2］。因此，揭示AD 发展的分子机制对于预防和治疗具有重要意义。各种miRNA在中枢神经系统中异常表达，可能参与AD 的发生和进展［4-5］。本研究揭示了miR-9-5p 在AD 发病机制中的新作用。miR-9-5p 在6 个月大的APP/PS1小鼠的海马和血浆中下调。Lv 介导的miR-9-5p 在海马中的过表达改善了APP/PS1 小鼠的突触可塑性并减轻了记忆缺陷。此外，miR-9-5p 过表达降低了Tau 过度磷酸化，并防止Tau 过度磷酸化诱导的DNA 损伤。因此，本研究结果表明miR-9-5p 在AD 发病机制中起重要作用，miR-9-5p 过表达可能是治疗AD 的潜在疗法。
miRNA 已被证明在突触可塑性中发挥关键作用，突触可塑性调节神经退行性疾病的发病机制，包括AD，如脆性X 智力迟钝蛋白相关的miR-125b和miR-132 对突触棘有抑制作用［12-13］。miR-181a在AD 小鼠中显著上调，而抑制miR-181a 可减轻记忆缺陷并增加其靶标GluA2在AD小鼠中的表达［14］。miR-101b 已被证实在海马神经元和AD 小鼠中调节APP，并且miR-101b 的过表达通过拯救组蛋白去乙酰化酶2来诱导Tau病理学和突触、记忆障碍［15］。先前的研究表明，miR-9-5p 与神经发生和脑细胞活力有关［16］，在6 个月大的APP/PS1 小鼠的海马中miR-9-5p 表达降低［8］；
并且miR-9-5p 的表达在散发性AD 患者的额叶回和皮质中下调［17］。与这些研究一致，本研究证实APP/PS1 小鼠的海马和血浆中miR-9-5p 降低，而miR-9-5p 过表达促进APP/PS1小鼠海马突触传递和增加突触棘密度，这与改善记忆功能有关。
作为微管相关蛋白，Tau 蛋白在生理条件下稳定微管并参与其他细胞功能，如微管组装、轴突运输、信号转导和细胞周期，这些功能受Tau 磷酸化的控制［18-19］。许多神经退行性疾病在中枢神经系统中存在显著的Tau 病理学［20］。在Tau 病变中，细胞内可溶性Tau 形成聚集的、过度磷酸化的Tau 丝状结构，这与突触丢失和神经元死亡有关［21］。作为许多神经退行性疾病的标志性发现，在APP/PS1小鼠中观察到异常Tau 磷酸化可能是认知障碍的主要原因［22］。此外，Tau 蛋白的异常过度磷酸化可能在麻醉或外周手术诱导的认知障碍和神经元凋亡的发病机制中发挥重要作用［23-25］。与先前研究报道的结果一致，本研究在6 个月大的APP/PS1 小鼠海马中观察到AT8 以及AT8 和γH2AX 共定位数量均显著增加，证实了异常Tau 磷酸化的存在，并导致海马DNA 损伤。值得注意的是，miR-9-5p 过表达逆转了这些变化，表明miR-9-5p 在AD 发病机制中发挥重要作用。
总之，本研究数据证明了miR-9-5p 在AD 发病机制中的有益作用，其保护机制涉及减少异常Tau磷酸化和DNA 损伤。因此，miR-9-5p 过表达可能是AD 的潜在治疗靶点。然而，miR-9-5p 过表达是否通过其他途径参与保护AD 仍有待研究。
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