【www.zhangdahai.com--其他范文】
左高雅，程宵婧，遇 洁，阴立锦，侯非凡，邢国明，李 森
（山西农业大学 园艺学院/大同黄花产业发展研究院，山西 太谷 030801）
黄花菜（Hemerocallis citrina），又名忘忧草、金针菜，萱草属多年生草本植物［1］。黄花菜的花蕾中含有丰富的维生素、蛋白质、糖类、纤维素、卵磷脂、钙、铁、磷、硒等物质，因此又是一种药食兼用的特色蔬菜［2］。黄花菜在我国栽培历史悠久，适应能力与繁殖能力强，其花形优美，色泽艳丽，还可作为绿化观赏的良好选择。
我国是世界黄花菜种质资源的分布中心，同时也是世界上黄花菜的主要生产地。在全国范围内，黄花菜种植地区主要集中分布于山西大同、陕西大荔、甘肃庆阳、湖南祁东、宁夏盐池和四川渠县等地，2020 年全国黄花菜共约100 万亩，已成为发展特色农业的代表性作物［3］。长期以来，黄花菜产业缺乏育种研究，各个产区黄花菜品种单一，缺乏优良品种。利用现代育种手段，培育新优品种是促进产业提质增效的重要内容之一。其中，选择优良株系，通过组织培养快速扩繁是实现黄花菜新优品种快速推广的重要途径。前期本团队及其他研究人员使用黄花菜的种子、叶片、花蕾、短缩茎［4-7］等作为外植体得到黄花菜的组培再生苗，但是受外植体取材时间、取材数量以及诱导愈伤组织的难易程度等因素影响，在实际生产中的应用还不广泛。使用黄花菜的花葶作为外植体，材料丰富，取材容易，能在较短的时间内诱导出大量愈伤组织并获得再生苗，是作为黄花菜新优品种工厂化育苗较为理想的方式。本研究以‘大同黄花’为例，以花葶为外植体探索黄花菜优良单株快速扩繁的技术，为今后黄花菜的遗传转化以及工厂化扩繁提供了理论依据。
1.1 供试材料
试验材料来源于山西农业大学园艺学院萱草属植物种质资源圃的‘大同黄花’（Hemerocallis citrina cv.‘Datong Huanghua’），于6 月下旬晴天的中午采样，选择暂未开花较为幼嫩的花葶为外植体，摘除花蕾待用。
1.2 试验方法
1.2.1 消毒接种方式 将‘大同黄花’花葶用自来水冲洗干净后，放在无菌瓶中，在超净工作台中用无菌水冲洗1 次，然后用75% 酒精消毒30 s，再用无菌水冲洗2 次，接着用消毒剂进行消毒灭菌，最后再用无菌水冲洗5 次，以上消毒期间均不断摇晃无菌瓶。消毒完成后用无菌镊子夹出花葶，无菌滤纸吸干表面水分，无菌手术刀切除花葶两端部分，将花葶沿横截面切为0.5 cm 的小段，在形态学下端纵切一刀以创造更大伤口形成愈伤组织，吸干伤口流出的液体后将其形态学下端朝上接种于培养基中。
1.2.2 不同消毒剂及处理时间对花葶外植体的影响用含5%次氯酸钠溶液和0.1%升汞溶液2 种消毒剂进行外植体的消毒灭菌，时间分别为5、10、15 min，每瓶接种5 个外植体，每个处理接种2 瓶，重复3 次。在培养室进行暗培养，15 d 后统计污染率及启动率。
1.2.3 不同外植体储存时间对愈伤组织诱导的影响花葶取样后，冲洗表面污垢，将其放入盛有水的容器中，置于4℃冰箱中储存，分别在取样的当天、储存2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 d 后接种，每瓶接种5 个外植体，每个处理接种2 瓶，重复3 次。在培养室中暗培养30 d 后统计出愈率。
1.2.4 不同激素配比对花葶外植体生长分化的影响将花葶接种于添加不同浓度6-BA（0、0.5、1.5、2.5 mg/L）和2,4-D（0、0.1、0.5、1 mg/L）的MS固体培养基中，每瓶接种5 个外植体，每个处理接种3 瓶，重复3 次。在培养室中暗培养30 d 后统计出愈率，然后转为光照条件下培养，30 d 后统计不定芽分化率。
1.2.5 生根培养及炼苗移栽 当诱导的不定芽长至3 cm 以上时，将不定芽单独切分下来转移到添加0.5 mg/L NAA 的生根培养基中，若不定芽长势过密难以切分开，可以丛生芽的方式转移。光照培养30 d 后观察生根情况。将生长健壮，根系发达的无菌苗进行炼苗移栽，在组培室中拧松瓶盖开小口炼苗3 d，取出并洗净附着在苗根部的培养基，将丛生苗小心拆分成单株苗，移栽于草炭+珍珠岩+蛭石（体积比为3∶1∶1）的混合基质中，浇足量水，并用小喷壶均匀喷施添加多菌灵和生根粉的1 000倍液，移栽后将苗盘放于半阴处缓苗，一周后再次喷施添加多菌灵和生根粉的1 000 倍液，转移到全光照的正常环境下管理。共计炼苗移栽50 棵组培生根苗，试验30 d 后统计成活率，观察植株长势。
1.3 培养条件
以上培养容器均采用容量为200 mL 的玻璃组培瓶，每升培养基分装35～40 瓶，培养基均添加4.3 g/L MS 粉，30 g/L 蔗糖，2 g/L 植物凝胶，培养基配制完成调节pH 为5.8～6.2，高压蒸汽灭菌条件121 ℃，20 min。培养室条件为光照强度1 500～2 000 lx，光照时间16 h/d，培养温度25±2 ℃。培养期间观察到外植体出现污染时，及时将瓶内其他未污染的外植体转入新鲜的培养基中。
1.4 数据处理与分析
采用Excel 进行数据处理；
SPSS 23.0 进行差异显著性分析和多重比较。
污染率=（污染的外植体数/接种的外植体数）×100%
启动率=（萌动的外植体数/接种的无污染的外植体数）×100%
出愈率=（形成愈伤组织的外植体数/接种的无污染外植体数）×100%
不定芽分化率=（愈伤组织分化不定芽的外植体数/形成愈伤组织的外植体数）×100%
成活率=（移栽后成活的组培苗数/移栽的组培苗数）×100%
2.1 不同消毒剂及处理时间对花葶外植体的影响
外植体接种（图1A）后，一般在2～10 d 内可以观察到污染现象，从表1 可以看出，不同消毒灭菌方式和时间处理后花葶外植体的污染率和启动率都有显著差异，在75%酒精、5%次氯酸钠溶液配合灭菌和75%酒精、0.1%升汞溶液配合灭菌2 种消毒灭菌方式中，随着灭菌时间的延长，外植体污染率和启动率均有所下降，说明消毒剂可有效消除外植体表面杂菌，同时随着时间的延长会对外植体产生毒害作用。当0.1%升汞溶液灭菌5 和10 min时，外植体污染率较低且2 个处理没有显著差异，但从外植体的启动（图1B）来看，灭菌10 min 对外植体的毒害作用更大，不利于后续试验的开展。因此综合考虑污染率和启动率2 个方面的因素，适宜的消毒灭菌步骤应为先用75%酒精灭菌30 s，再用0.1%升汞溶液灭菌10 min，可将污染率降低至16.67%，启动率达到88.43%。
表1 不同消毒处理对愈伤组织污染率和启动率的影响Table 1 Effects of different disinfection treatments on callus contamination rate and initiation rate
图1 ‘大同黄花’花葶组织培养脱分化过程Fig.1 Dedifferentiation process of scape tissue culture of Hemerocallis citrina cv. ‘Datong Huanghua’
2.2 不同外植体储存时间对愈伤组织诱导的影响
4 ℃冰箱中储存的过程中，花葶放入保持有水的容器状态下，20 d 内并无萎蔫或干枯现象。接种暗培养30 d 后，从图2 中可以看出，随着储存时间的延长，外植体的出愈率逐渐降低，花葶储存时间为0、2、4、6 d 时得到的出愈率均无显著差异，可得到正常愈伤组织；
储存时间超过12 d 后，出愈率会下降一半；
储存时间为16 d 以后时，得到的出愈率均无显著差异，几乎不再产生愈伤组织；
储存18 d后，外植体出愈率为0。因此，花葶取材后在6 d 内接种效果最佳。
图2 不同外植体储存时间对愈伤组织诱导的影响Fig.2 Effect of different storage time of explants on callus induction
2.3 不同植物激素配比对花葶外植体生长分化的影响
暗培养30 d 后，花葶的切口部位产生白色的愈伤组织（图3A），从表2 中可以看出，在不添加6-BA 的培养基中无任何愈伤组织的出现，添加0.5～2.5 mg/L 6-BA 的培养基中均可产生愈伤组织，添加1.5 mg/L 6-BA 或2.5 mg/L 6-BA 时，随着2,4-D 的浓度增大，出愈率反而降低，且添加了2.5 mg/L 6-BA的培养基上得到最大出愈率，这与添加1.5 mg/L 6-BA，2.5 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L 2,4-D，2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L 2,4-D 后的培养基得到的出愈率均无显著差异。当由暗培养转为光照培养后，白色的愈伤组织逐渐转变为绿色（图3B），接着产生芽点进而分化出不定芽（图3C），从表2 中可以看出，添加了2.5 mg/L 6-BA 的培养基中得到最大的不定芽分化率，这与添加1.5 mg/L 6-BA，1.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L 2,4-D，2.5 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L 2,4-D后的培养基得到的不定芽分化率均无显著差异。可见，‘大同黄花’花葶外植体在只添加6-BA 的培养基中也可诱导出愈伤组织和分化不定芽，并且随着时间的延长，在不添加6-BA 的培养基中花葶外植体最终褐化死亡（图4A），添加2.5 mg/L 6-BA的培养基中芽分化情况相对来说更好（图4B、C）。因此综合考虑出愈率和不定芽分化率，选择添加激素浓度为2.5 mg/L 6-BA 的MS 培养基可获得最多愈伤组织和不定芽。
图4 不同植物激素配比下芽分化情况Fig.4 Bud differentiation under different plant hormone ratios
表2 不同植物激素配比对外植体生长分化的影响Table 2 Effects of different plant hormone ratios on the growth and differentiation of explants
图3 ‘大同黄花’花葶组织培养再分化过程Fig.3 Redifferentiation process of scape tissue culture of Hemerocallis citrina cv. ‘Datong Huanghua’
2.4 生根培养及炼苗移栽
将分化的不定芽（图5A）转入添加0.5 mg/L NAA 的生根培养基后，15 d 后陆续从无根苗的基部出现乳状突起，之后出现白色或黄色的根毛，30 d后形成完整再生植株（图5B），经过炼苗移栽30 d后，组培苗成活数量为47 棵，成活率为94.00%，植株生长状态良好（图5C）。
图5 再生植株形成Fig.5 Regeneration plantlet formation
植物组织培养中，污染关系着植物体能否正常生长发育和后续操作能否正常进行，污染的原因主要有操作环境不清洁造成的污染、接种人员操作不当造成的污染、培养环境不清洁造成的污染以及外植体自身的污染源［8］，从田间采取的花葶外植体表面常含有大量杂菌，因此接种前选用合适的消毒剂进行灭菌是确保外植体表面无菌的不可缺少的步骤，且消毒时间过短会使消毒不彻底，对杂菌的抑制效果不明显［9］，必要时还可对外植体进行二次灭菌［10］，时间过长会产生毒害作用导致植物体细胞破裂、加剧褐化程度［11］，使其不能正常生长发育。在萱草属植物的组织培养中，常用的消毒剂有酒精、次氯酸钠、升汞、过氧化氢、福尔马林等。本试验采用75%酒精配合5%次氯酸钠溶液和0.1%升汞溶液对花葶外植体消毒灭菌，结果表明，0.1%升汞溶液灭菌效果要好于5%次氯酸钠溶液灭菌效果，0.1%升汞灭菌10 min 时外植体污染率较低，且对外植体启动出愈影响不大，故采用75%酒精灭菌30 s 配合0.1%升汞灭菌10 min 为‘大同黄花’花葶的适宜消毒灭菌方法。除外植体的严格消毒外，平时需要定期对操作间及培养室紫外线灯照射消毒、酒精喷雾降尘消毒或用福尔马林熏蒸消毒以排除环境污染［12］，接种人员需要严格规范组织培养中各项操作环节。
黄花菜的花期主要集中于每年的6 月下旬至7月下旬［13］，而可用于组织培养的幼嫩花葶所采集的时间段可能还不足一个月，因此黄花菜花葶外植体的取材受花期和季节的限制，研究黄花菜取材后的储存对于工厂化生产来说十分重要。考虑到新鲜花葶大量取材后如不能及时接种，在常温下保存又容易萎蔫失去分化能力，将其放入4 ℃冰箱中储存具有保存所需条件简单、对材料的要求及处理过程简单的优点［14］。刘静等［15］研究发现茶树种子经过一段时间4 ℃冷藏处理后，种子萌发率远高于常温储存。本试验中发现将新鲜花葶外植体在4 ℃冰箱中储存2、4、6 d 之后接种与未经储存的新鲜花葶接种所得到的出愈率没有显著差异，说明这样的储存条件在延长外植体生命活力的同时也保持了其分化能力，但是随着时间的延长，接种后未产生愈伤组织的外植体均在切口处产生褐化，这可能由于低温导致的外植体酶促褐变的生理现象［16］。
植物生长调节剂是影响植物组织培养与离体再生的重要因素之一，植物生长调节剂种类、剂量的选择以及不同植物生长调节剂间的配比的选择是探讨高效率进行植物愈伤组织诱导和分化的关键所在［17］。在黄花菜的组织培养中，常用的植物生长调节剂有生长素类NAA，2,4-D，IAA 等，细胞分裂素类6-BA，KT 等，王静等［18］以幼叶为外植体在添加2 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA 的培养基中诱导出大量愈伤组织；
范银燕等［19］在添加2 mg/L 2,4-D的培养基中以花葶为外植体愈伤组织诱导率最高，以添加 1mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的培养基为芽分化培养基；
韩志平等［20］以种子为外植体在添加2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的培养基中诱导分化成芽，在添加0.2 mg/L NAA 的培养基上壮苗生根。本试验中发现‘大同黄花’花葶愈伤组织诱导不需要生长素类激素的参与，在仅添加2.5 mg/L 6-BA的MS 培养基中可形成大量愈伤组织，并且不需要更换培养基配方即可分化成芽，甚至在同一培养基配方继代培养后发现有少量芽可直接生根，这种“一步成苗”现象在组织培养中十分少见，可节约成本、简化操作步骤，具有很大的研究意义。然而本试验中用到的6-BA 浓度最大为2.5 mg/L，至于影响花葶外植体出愈及分化的最佳浓度范围还有待研究。
