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权 莹，张晓娟，赵 辉，孙晓敏，马秀奇
（1陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723001；
2陕西理工大学体育学院，陕西汉中 723001；
3陕西省汉中市农业科学研究所，陕西汉中 723001）
基因组编辑技术是通过特定核酸酶对基因组特定位点进行编辑和修饰的一项技术。CRISPR/Cas9即规律间隔短回文重复序列及其相关核酸酶9[1]，是目前最先进也是应用最广泛的一项高效、简便的基因定点编辑技术，较之前的两种基因编辑技术（ZFNs和TALENs)具有较大的优势。CRISPR/Cas9是根据细菌防御外界噬菌体侵染的分子机制构建的体系。它是由RNA介导，借助Cas9蛋白对基因组进行定点切割，然后通过机体的修复机制将DNA重新连接，或将新基因插入到基因组中的一项基因编辑技术[2]。该技术在基础研究、作物育种、基因治疗等领域具有广阔的应用前景。
CRISPR/Cas9应用于植物领域，具有特异性较高、脱靶率低的特点[3-4]，是作物育种改良快速、有效、安全的途径，它可对多个基因同时编辑，促进育种向高效、快速、低成本方向发展。近年来，该系统已在高粱[5]、玉米[6]、番茄[7]、油菜[8]、大麦[8]、矮牵牛[9]、葡萄[10]、甜橙[11]、大豆[12]、棉花[13]、杨树[14]、甘蔗[15]等多种作物中取得成功应用，发展前景广阔。
CRISPR/Cas普遍存在于古生菌和细菌中，其作为细菌/古生菌的获得性免疫系统，能够特异识别并降解再次入侵的外源DNA分子（如噬菌体等）[16-17]。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)组成包括两部分，即高度保守的重复序列以及位于其间的间隔序列，间隔序列的作用是特异性识别外源DNA分子。外源DNA分子入侵宿主时，前者DNA中的原型间隔序列被Cas9蛋白特异切割，之后整合到宿主的CRISPR位点，成为CRISPR间隔序列。当其再次入侵时，宿主DNA中的“重复-间隔”序列转录、加工成小的crRNA，然后与tracrRNA(trans-activating crRNA)配对结合，之后识别、结合Cas9蛋白并最终形成RNA-蛋白复合体[18]。该复合体特异识别入侵DNA分子中的原型间隔序列毗邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)，PAM的存在是导致其上游的原间隔序列被切割的先决条件。crRNA中的间隔序列通过与入侵DNA上的原间隔序列互补配对，介导Cas9蛋白对外源DNA特异性切割[19-20]，引起DNA双链断裂，接着由宿主的DNA修复系统进行修复[21-22]，从而形成基因组定点插入、缺失等编辑。
目前，CRISPR/Cas系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型。其中，Ⅱ型系统仅有1个Cas蛋白，也就是Cas9蛋白，其核酸酶切割功能域由Ruv C和HNH结构域组成，可分别切割靶DNA双链[23]。II型系统组成简单，CRISPR/Cas9技术就是由该系统改造而来的。
CRISPR/Cas9基因编辑系统具有多种优势。首先，该技术非常简便、经济。其载体构建简单，研究者只需要设计合成20 bp的sgRNA。其次，CRISPR/Cas9系统生物安全性高，通过回交分离，该技术可获得无外源基因的类似于自然突变的突变株系[24]。再次，CRISPR/Cas9技术可同时编辑多个靶基因，将其应用于多倍体植物基因功能研究[25]，可解决植物中由于存在多个同源基因或者多个基因平行参与某个信号途径，导致的单个基因敲除并不能产生功能变化的问题。此外，该技术克服了分子标记辅助育种中的连锁累赘和分子标记丢失问题，对作物的其他性状基本没有影响。
Jinek等[20]将crRNA和tracrRNA合并，形成一条单链引导RNA（即sgRNA），由该RNA引导Cas9蛋白对靶序列实施定点切割，实现了CRISPR/Cas系统的简化改造。研究者只需要根据靶基因NGG位点上游20个碱基设计一条sgRNA，即可通过CRISPR/Cas9系统快速实现靶基因的切割、编辑。在水稻中的研究表明，使用sgRNA要比crRNA和tracrRNA两者配合使用效率更高[26]。
CRISPR/Cas9系统应用于植物基因编辑，其突变效率和特异性受sgRNA、Cas9蛋白、靶序列及启动子等因素影响，对这些影响因素进行优化，可提高该系统的效率和精确性[27-28]。sgRNA序列对CRISPR/Cas系统的特异性具有主要决定作用，Cas9切割位点的确定由sgRNA与靶序列配对完成。设计sgRNA时，应保证其序列特异性。测序分析表明，sgRNA的3′端序列与靶DNA的配对对于识别和介导靶基因突变更为重要，3′端距离PAM的8～12个序列主要影响sgRNA的特异性，是sgRNA的核心序列[29]。sgRNA的GC含量也影响CRISPR/Cas9系统的特异性，在其5′端添加2个碱基GG，可减低其脱靶率[30]。sgRNA长度一般设计为17～20 nt；
适当缩短sgRNA的长度（15个碱基）可减少脱靶率，但编辑效率会降低[31]。sgRNA的表达量[32]及表达策略也影响CRISPR/Cas9的编辑效率[33]。
对Cas9核酸酶结构进行改造可提高CRISPR/Cas9系统特异性。通过突变Cas9蛋白的RuvC或HNH结构域，将其改造为仅能切割单链DNA的单切口酶，将后者与“paired-g RNAs”结合进行基因组编辑，可有效提高系统特异性[34]。此外，增加Cas9的切口酶活性能减少脱靶效应[35]。Cas9基因的表达水平也影响CRISPR/Cas9系统编辑效率[36]。
CRISPR/Cas9中，靶序列组成、GC含量影响靶DNA的切割效率[37]。水稻中研究表明，GC含量高(50%～70%)的目标基因组具有较高的编辑效率[27]。
启动子也是影响Cas9基因表达水平以及基因编辑效率的关键因素。在水稻中，用Ubiquitin启动子编辑效率明显高于CaMV35S启动子[38]。在双子叶植物中，采用CaMV35S启动子可高效表达Cas9基因[39]。此外，PAM序列，一般为NGG，也对CRISPR/Cas9系统基因编辑效率存在影响。除了识别NGG外，NRG（R代表A或G）也可被Cas9识别，但切割频率显著降低，只有NGG的1/5[40]。
CRISPR/Cas9技术可快速地对基因进行敲除，为植物基因功能、基因表达调控及功能基因组学等研究提供了快速有效的途径。
3.1 基因定点敲除或插入
目前，通过基因敲除进行编辑为CRISPR/Cas9系统在植物中应用的主要方式。碱基删除数目越多，出现的频率越低[27]。Wang等[41]利用CRISPR/Cas9系统对水稻品种‘空育131’的负调控稻瘟病菌抗性及耐盐性的OsERF922基因进行敲除，得到抗稻瘟病的突变材料。王凯婕等[42]利用该技术对水稻OsRhoGDI2基因进行定点敲除，获得的突变体株高较对照显著降低。
外源基因的插入，可通过HDR途径，采用导入含目的基因同源臂的外源DNA实现[43]。Schiml等[44]首次通过CRISPR/Cas9系统，以两端含有与间隔序列相同的DNA为模板，将NPTII基因片段通过DNA的同源重组修复机制成功导入拟南芥ADHI基因位点。沈春修[45]采用CRISPR/Cas9系统对耐冷性较强的粳稻品种LOC_Os10g05490位点进行定点编辑，得到了基因敲除突变体。
3.2 基因表达调控研究
CRISPR/Cas9系统经改造后可用于基因表达调控研究。突变Cas9蛋白的核酸酶结构域（HNH和RuvC），将Cas9蛋白改造成仅具有DNA结合功能的缺陷型核酸酶dCas9，然后与具有转录调控作用的蛋白结合，在crRNA引导下，识别靶基因并对其进行激活或抑制[18]。
CRISPRi(CRISPR interference)又称CRISPR干扰。该系统将dCas9与KRAB、SID、RNAP等具有转录阻遏功能的结构域融合，对靶基因进行抑制[46]。Piatek[47]利用CRISPR/dCas9系统，将转录抑制结构域SRDX与dCas9蛋白的C端融合形成dCas9-SRDX，成功在烟草中干扰了PDS基因的表达。
CRISPR-on系统则具有转录激活活性作用。该系统中，dCas蛋白与VP16/VP64、p65、EDLL等转录激活结构域融合，从而激活靶基因的表达[48]。Zetche等[49]基于FRB和FKBP两者互作，实现了转录激活效应子VP64对靶基因表达的促进。
此外，研究者们还开发了以CRISPR/Cas9系统为基础的新的基因表达调控技术。Zalatan等[50]对dCas9系统进行改造，将sgRNA转化为具有招募RNA结合蛋白功能的scRNA(scaffold RNA)，通过连接在RNA结合蛋白上的效应蛋白对靶基因进行转录调控。
4.1 植物基因组定点编辑
目前，该技术已广泛应用于植物基因定点突变及基因定点整合等研究。Zhang等[51]利用CRISPR/Cas9技术，在水稻不同亚种中，选择11个目标基因进行编辑，T0代植株中突变效率即达到了66.7%，且有6个靶位点为纯合基因型。拟南芥中，廖嘉明等[52]利用CRISPR/Cas9系统构建了扩展蛋白EXPA的多基因编辑表达载体pHEE401E-AtEXPAs，实现了拟南芥扩展蛋白的多基因突变。Wang等[53]利用CRISPR/Cas9技术在六倍体小麦中对单个TaMLO位点进行编辑，在T0转基因株系中鉴定到4株突变位点不同的突变体。Abe等[54]应用CRISPR/Cas9技术，采用农杆菌介导方式，成功获得调控小麦休眠的Qsd1基因的三重敲除突变体。
CRISPR/Cas9技术还可同时修饰多倍体植物中的不同同源基因。Braatz等[55]仅使用一个靶序列，在T1代油菜中实现了ALC的4个等位基因同时突变。
4.2 CRISPR/Cas9在作物分子育种中的应用
随着测序技术的发展，作物遗传改良已经由常规杂交向高效、精准的定向育种转变。CRISPR/Cas9技术可对基因组特定位点进行精准编辑和修饰，克服了传统转基因技术中随机插入导致的内源基因失活、外源基因沉默等缺点，在作物品种定向改良中具有重要的应用价值。
利用CRISPR/Cas9技术对控制作物重要性状的基因进行定点编辑，如对控制作物产量、品质、抗性的负调控因子进行敲除，调控相关代谢过程，可快速获得具有优良性状的突变体，大大缩短优质、高产、多抗作物新品种的选育周期[56]。
徐鹏等[57]利用CRISPR/Cas9系统对稻瘟病抗性相关基因进行编辑，获得了抗性明显增强的水稻Pi21单突变纯合株系及三基因（Pita、Pi21和ERF922）突变纯合株系，为水稻抗稻瘟病育种提供了育种材料。Xu等[58]对控制粒重的3个基因（GW2、GW5和TGW6）同时进行基因定点编辑，得到粒重较对照明显增加的gw5tgw6二基因突变体和gw2gw5tgw6三基因突变体，可用于水稻高产育种。汪秉坤等[59]对水稻直链淀粉基因-Waxy(Wx)进行定点敲除，得到低直链淀粉含量并且可稳定遗传的株系，直链淀粉含量由之前的17.5%降至1.93%。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对控制花粉或花药发育过程的基因进行编辑可快速创制新型不育系，促进水稻杂种优势利用[60]。覃玉芬等[61]通过CRISPR/Cas9系统对TMS5基因进行编辑，T0代纯合突变体高达58.4%，研究获得了无外源DNA的温敏雄性核不育系GXU41-5S。
小麦中，Zhang等[62]报道了基于突变植株瞬时表达CRISPR/Cas9 DNA（缩写为TECCDNA）的基因组编辑方法。该研究对控制小麦籽粒长度和重量的TaGASR7基因和控制花序结构并影响穗生长和籽粒产量的TaDEP1基因进行定点敲除，在T0代即获得不含转基因成分的纯合敲除突变体。
玉米中，Svitashev等[63]采用CRISPR/Cas9系统对ALS2基因定向敲除，获得了抗磺胺脲除草剂的突变体植株。Shi等[64]利用CRISPR/Cas9技术获得了玉米AGROS8突变体，该突变体抗旱性增强且在干旱胁迫下仍有较高产量。
CRISPR/Cas9技术在植物中应用虽然具有明显的优势，但也存在一些不足，主要表现为CRISPR/Cas9系统存在脱靶现象[65]，需进一步提高其特异性。此外，CRISPR/Cas9系统存在通过同源重组(HDR)方式定点导入基因效率较低的问题，需进一步改造该系统，提高基因靶向导入效率。Miki等[66]以CRISPR/Cas9技术为基础，结合二代转化策略，在拟南芥中实现了超长DNA片段的高效精确敲入及替换。它不需要标记辅助筛选，插入或替换效率高达5%～10%。
CRISPR/Cas9系统作为一项简单、高效、低成本且安全性较高的作物育种新技术，大大提高了作物遗传改良和良种选育的效率，推动了作物精确育种研究。今后，通过HDR方式定向导入控制重要农艺性状的正调控基因以及通过基因定点整合实现多个优良农业性状的聚合将成为该技术在作物遗传改良以及育种中的重点研究方向。
CRISPR/Cas9技术在植物表观遗传学等研究领域同样具有良好的应用价值。将dCas9与甲基化酶、磷酸化酶等表观修饰因子融合对染色体进行定点表观修饰，可以研究特定基因表观修饰的功能[18]。将CRISPR/Cas9系统与单分子标记技术相结合可实现对活细胞内染色体、基因构象及动力学的研究[67]。CRISPR/Cas9技术还可用于调控植株代谢网络，通过对某个代谢途径中的关键基因进行定点编辑，从而对植株代谢进行调控，提高次生代谢物含量，在提高经济效益的同时减少药用植物资源的采挖，保护植物资源。Cas9/sgRNA系统在病毒防御中也具有很好的应用前景。利用Cas9蛋白对病毒基因或受体基因进行突变从而阻止病菌入侵，是植物抗病毒研究的有效方法[68]。
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