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李炳锋，段雅倩，王 旭，郭美丽，高 越,1b （1. 海军军医大学：a. 药学院, b. 第一附属医院临床研究中心, 上海 00433；
. 中国人民解放军63600 部队医院, 甘肃 酒泉 73750）
氧气是生命活动的基本物质，在机体内主要参与能量代谢过程。作为一种至关重要的生命物质，氧气在多个层面影响着机体，甚至可以通过多种渠道影响基因[1]。Kirmes 等的研究表明：在缺氧条件下，细胞在全基因组水平上会产生结构变化，染色质会发生聚集现象[2]。机体缺氧时，通过氧化呼吸链产生过多的活性氧簇（ROS），包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。ROS 不仅可以直接损伤脂质、蛋白质及核酸等生物大分子，还可以通过Fas/FasL、TNF-α/TNFRl、MAPK 等信号通路诱导细胞凋亡[3-4]。目前，针对缺氧的防治，西药主要有碳酸酐酶抑制剂、糖皮质激素、茶碱等，中药较为成熟的有藏药红景天，胡黄连、黄芪等也被认为具有一定的抗缺氧损伤的能力[5]。乙酰唑胺作为FDA认可的唯一一种防治急性缺氧的药物，更多的是用来治疗急性缺氧，且其存在过敏反应、四肢麻木、疲劳、困倦等不良反应，肝肾功能异常的人不宜使用[6-8]。藏药红景天目前已被高原边防部队作为防治高原缺氧的常规药物。大部分学者认为红景天可以通过抑制氧化应激、抗凋亡、保护神经细胞等方式治疗缺氧性损伤，但其主要活性成分的抗缺氧作用机制仍不清楚[9]。作为预防用药，红景天需要提前7～15 d 服用，才能较好起到提高抗缺氧能力的作用，疗程较长。目前，针对缺氧的治疗仍以给予高浓度氧气最为直接有效，而对于提高耐缺氧能力，目前尚无安全高效的药物。
毛裂蜂斗菜（Petasites tricholobuson）是菊科蜂斗菜属下的一种，在民间广泛用于消肿止痛、解毒祛瘀，治跌打损伤、毒蛇咬伤等。课题组前期实验已经证明，其醇提取物具有抗炎作用[10-12]。本实验通过观察PTB 对小鼠存活时间、血清乳酸脱氢酶（LDH）活性和丙二醛（MDA）含量变化，对脑组织与心脏超氧化物歧化酶（SOD）和还原型谷胱甘肽（GSH）活性变化、脑组织病理变化，以及对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）制成糖氧剥夺模型(OGD)后存活率的影响，进一步探讨PTB 的抗缺氧能力及可能的作用机制。
1.1 动物与细胞株
昆明种小鼠110 只，雄性，SPF 级，体质量23～25 g，合格证号：SCXK（京）2019-0010（斯贝福生物技术有限公司），饲养于清洁级动物房，人工照明模拟昼夜变化；
PC12 细胞（美国ATCC 细胞库）。
1.2 药物
蜂斗菜总内酯（自提）：经高效液相色谱（HPLC）检测，蜂斗菜总内酯含量为74.8%，其中，内酯B、内酯Ⅲa、内酯Ⅳa 的含量分别为13.4%、46.8%、14.6%，各单体成分分子结构式均已明确[13]；
诺迪康胶囊（规格：0.28 g/粒，西藏诺迪康药业股份有限公司，批号：200402）；
0.9%氯化钠溶液（500 ml，济民健康管理股份有限公司，批号：S200516E52）；
LDH 试剂盒、GSH 试剂盒、总蛋白定量测试盒、MDA 试剂盒、SOD 测试盒（南京建成生物工程研究所），规格：96T，批号：20210914、20211012、20210603、 20211012、 20211012；
MTT（ 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）（美国Sigma 公司）；
高糖DMEM 培养基、胎牛血清（美国Hyclone 公司）；
混合气体（95%N2，5%CO2）（上海成功气体工业有限公司）；
CO2气体（海军军医大学热卫系）。
1.3 仪器
全自动酶标仪、1 300 SERIES A2 型超净台（美国Thermo 科技公司）；
SHIMADZU LC-20 高效液相色谱仪（岛津有限公司）；
Pico17 高速离心机（ThermoFisher 科技公司）；
L-420 低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；
Tissuelyser-48 多样品组织研磨机（上海净信实业发展有限公司）；
DHG.9.23A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；
DK-8D 型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）。
1.4 实验方法
1.4.1 分组及给药
小鼠适应性饲养3 d，常规进食，自由饮水。根据预实验结果，采用随机数字法将小鼠分为空白对照组、模型组、阳性对照组（诺迪康280 mg/kg）、PTB 低剂量组（20 mg/kg）、PTB 中剂量组（40 mg/kg）、PTB 高剂量组（80 mg/kg），其中空白对照组10 只小鼠，其余各组20 只小鼠。适应性饲养3 d 后，按照小鼠质量10 ml/kg 灌胃给药，连续给药3 d，空白对照组和模型组给予等体积的溶剂CMC-Na。本实验过程遵守动物福利、动物保护和伦理原则及相关规定。
1.4.2 常压缺氧实验
第3 天给药1 h 后，除空白对照组外，取其余每组小鼠各10 只分别置于125 ml 磨口广口瓶中（瓶内放置5 g 钠石灰，用于吸附CO2），瓶口涂抹凡士林保证绝对密封，自盖上瓶盖开始计时，以小鼠呼吸心跳停止为小鼠窒息死亡判定依据，记录并统计各组小鼠死亡时间。
1.4.3 取材
根据小鼠常压密闭缺氧实验结果，将小鼠最短死亡时间（12 min）设为时间节点。除空白对照组外，将其余5 组剩余小鼠分别置于125 ml 磨口广口瓶中（瓶内放置5 g 钠石灰，用于吸附CO2），瓶口涂抹凡士林保证绝对密封。自盖上瓶盖开始计时，到达时间节点后立即将小鼠取出，眼眶取血，血液样品放置于冰盒中保存。空白对照组于常压未缺氧条件下直接眼眶取血。各组小鼠眼眶取血后，立即脱颈处死，解剖并小心分离出脑组织，于冰盘上快速分离出右侧大脑半球，置4%多聚甲醛固定液中。左侧大脑半球保存在清洁干燥离心管中。脑组织固定后，解剖分离出小鼠心脏，用生理盐水充分灌洗后，用清洁滤纸吸干。所有样品均放置于液氮中临时保存。
1.4.4 脑组织病理染色
将各组小鼠右侧大脑半球切片制作成石蜡切片，分别通过脱蜡、染色、分化、封片等步骤，进行HE 和尼氏染色。染色切片制作完成后进行显微镜镜检，图像采集分析。
1.4.5 生化指标检测
将取得的血液样品进行离心处理（4 000 r/min，10 min），取上清液进行LDH 活性、MDA 含量的测定。将取得的心脏、左侧大脑半球称重，按照组织与生理盐水1∶9 的比例，低温条件下制成10%的组织匀浆，进行SOD、GSH 活性的测定。MDA 含量、LDH 活性、SOD 活性、GSH 活性的检测按照试剂盒说明书进行。
1.5 体外实验
1.5.1 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12 细胞）的培养
将PC12 细胞置于CO2细胞培养箱内培养（95%空气和5%CO2，37 ℃，饱和湿度），培养基由90%高糖DMEM 和10%胎牛血清（FBS）组成，每3 d 更换新的培养基。当细胞的生长达到80%～90%汇合度时，对细胞进行传代培养。细胞传代时，先弃去培养瓶内的培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2 次，加入不含EDTA 的胰酶消化细胞，按照1:4 的比例进行传代分瓶培养。待细胞生长状态稳定处于对数期生长时进行后续实验。
1.5.2 药物配制
称取适量蜂斗菜总内酯，加入无糖培养基配制成2000 ng/ml 的溶液。按照比例，用无糖培养基将液体分别稀释为200 ng/ml 和20 ng/ml 的溶液。
1.5.3 PC12 细胞氧糖剥夺模型（OGD）的建立及药物处理
待铺于细胞培养板内的细胞汇合度达到80%且生长状态良好时，将原有培养基弃去，PBS 冲洗2 次后，模型组加入无糖培养基，给药组加入含有不同浓度PTB（20 、200、2000 ng/ml）的无糖培养基，置于缺氧装置（95% N2，5% CO2）内缺氧2 h 后，将该装置移入37 ℃的恒温培养箱继续孵育12 h形成OGD 模型。空白对照组照常更换培养基一次，在正常细胞培养环境下培养。
1.5.4 MTT 法检测细胞存活率
将状态良好的细胞以5×104个/ml 的密度铺于96 孔细胞培养板，MTT 法检测细胞存活率。MTT实验检测开始时，在各细胞培养孔中加入20 μl MTT 溶液(5 mg/ml, 即0.5%MTT)，继续在37 ℃细胞培养箱内孵育4 h。弃细胞上清液，每个细胞孔加入150 μl DMSO 溶液，摇床上低速震荡10 min，使沉积在细胞内的结晶充分溶解。在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值（A值）。根据各组所得的A值，计算细胞的存活率，其中，未经OGD 处理的空白组细胞的存活率均一化为100%，其余各组细胞的存活率是相对于空白组比值的百分比。细胞的存活率=（A值实验组/A值空白组）×100%。
1.6 统计学处理
采用SPSS21.0 统计分析软件处理。计量资料数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，当P＜0.05 时，表示差异有统计学意义。
2.1 PTB 对常压缺氧小鼠存活时间的影响
常压缺氧条件下，模型组小鼠的平均存活时间为859.5 s。与模型组相比，阳性对照组（诺迪康）小鼠的存活时间延长了131.9 s（P＜0.05），PTB 低、中、高剂量均能显著延长小鼠的存活时间（P＜0.05，P＜0.01），结果见表1。
表1 PTB 对常压缺氧小鼠存活时间的影响(n=10， ±s)
表1 PTB 对常压缺氧小鼠存活时间的影响(n=10， ±s)
*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组比较。
组别 给药剂量（mg/kg） 存活时间（t/s）模型组 - 859.5±84.56诺迪康组 280 991.4±140.7*PTB低剂量组 20 1 023±142.7**PTB中剂量组 40 980±120.5*PTB高剂量组 80 1 055±251.9*
2.2 PTB 对常压缺氧小鼠血清LDH 活力、MDA含量的影响
与空白对照组相比，模型组的LDH 活力明显增高（P＜0.01）；
与模型组相比，阳性对照组（诺迪康）、PTB 中、高剂量组LDH 活力降低至空白组水平（P＜0.05）；
低剂量组的LDH 活力较模型组有所降低，但没有统计学差异（P＞0.05），见表2。
与空白对照组相比，模型组的MDA 含量显著增高（P＜0.01）；
与模型组相比，阳性对照组（诺迪康）、PTB 低、中剂量组MDA 含量降低（P＜0.05）；
PTB 高剂量组MDA 含量有所降低，但没有统计学差异（P＞0.05），见表2。
表2 PTB 对常压缺氧小鼠血清LDH 活力和MDA 含量的影响(n=10， ±s)
表2 PTB 对常压缺氧小鼠血清LDH 活力和MDA 含量的影响(n=10， ±s)
*P＜0.05，与模型组比较；
##P＜0.01，与空白组比较。
组别 给药剂量（mg/kg） LDH（U/L） MDA（nmol/ml）空白组 - 1 052±59.49 67.04±12.63模型组 - 1 280±206.6## 204.3±58.42##诺迪康组 280 1 092±70.16＊ 132.5±54.02＊PTB低剂量组 20 1 153±82.80 138.3±32.50＊PTB中剂量组 40 1 097±100.5＊ 152.8±48.90＊PTB高剂量组 80 1 059±187.8＊ 172.7±60.54
2.3 PTB 对常压缺氧小鼠脑组织、心脏的GSH活力的影响
在脑组织中，与空白对照组相比，模型组的GSH 活力降低（P＜0.01）；
与模型组相比，阳性对照组（诺迪康）的GSH 活力有所升高，但是没有统计学差异（P＞0.05）；
与模型组相比，PTB 低、中、高3 个剂量组的GSH 活力均显著升高（P＜0.01），见表3。
在心脏中，与空白对照组相比，模型组的GSH 活力降低（P＜0.05）；
与模型组相比，阳性对照组（诺迪康）的GSH 活力升高（P＜0.05）；
与模型组相比，PTB 低、中、高3 个剂量组的GSH 活力均显著升高（P＜0.01），见表3。
表3 PTB 对常压缺氧小鼠脑组织和心脏GSH 活力的影响(n=10， ±s)
表3 PTB 对常压缺氧小鼠脑组织和心脏GSH 活力的影响(n=10， ±s)
*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组比较；
#P＜0.05，##P＜0.01，与空白组比较。
心脏GSH（μmol/g·prot）空白组 - 44.17±8.672 9.123±2.906模型组 - 31.99±5.528## 5.772±2.537#诺迪康组 280 37.47±13.56 8.345±2.336*低剂量组 20 43.38±10.46** 13.42±3.606**中剂量组 40 47.57±8.106** 12.07±4.191**高剂量组 80 50.36±17.18** 12.59±1.820**组别 给药剂量（mg/kg）脑GSH（μmol/g·prot）
2.4 PTB 对常压缺氧小鼠脑组织、心脏的SOD活力的影响
在脑组织中，与空白对照组相比，模型组的SOD 活力降低（P＜0.05）；
与模型组相比，阳性对照组（诺迪康）的SOD 活力变化没有统计学差异（P＞0.05）；
与模型组相比，PTB 低、中、高3 个剂量组的SOD 活力均显著升高（P＜0.01），见表4。
在心脏中，与空白对照组相比，模型组的SOD 活力降低（P＜0.05）；
与模型组相比，阳性对照组（诺迪康）、PTB 低、中、高3 个剂量组的SOD 活力均显著升高（P＜0.01），见表4。
表4 PTB 对常压缺氧小鼠脑组织和心脏SOD 活力的影响(n=10， ±s)
表4 PTB 对常压缺氧小鼠脑组织和心脏SOD 活力的影响(n=10， ±s)
**P＜0.01，与模型组比较；
#P＜0.05，与空白组比较。
心脏SOD（U/mg·prot）空白组 - 71.75±19.92 100.7±13.16模型组 - 58.06±4.552# 85.26±16.80#诺迪康组 280 56.88±14.44 115.6±15.00**低剂量组 20 68.98±10.70** 139.7±25.62**中剂量组 40 80.27±18.47** 124.7±21.92**高剂量组 80 79.60±21.02** 127.1±12.15**组别 给药剂量（mg/kg）脑SOD（U/mg·prot）
2.5 PTB 对常压缺氧小鼠脑组织病理形态的影响
如图1 所示，与空白对照组相比，模型组小鼠神经细胞排列明显紊乱，细胞之间存在大量空泡（箭头所示）；
与模型组相比，阳性对照组及PTB中、高剂量组的小鼠脑组织排列较整齐，细胞间空泡较少，神经纤维束的走行较为整齐统一。
图1 HE 染色观察小鼠脑组织病理变化(40×)
尼氏染色下，与空白对照组相比，模型组海马区尼氏小体（箭头所示）明显减少，海马区细胞排列紊乱；
与模型组相比，阳性对照组及PTB 各剂量组的尼氏小体明显增加，细胞排列规则，见图2。
图2 尼氏染色观察小鼠脑组织病理变化( 40×)
2.6 PTB 对OGD 处理PC12 细胞存活率的影响
如表5 所示，空白组细胞存活率为100.00%，模型组细胞存活率下降至(37.26±3.80) %，与空白组相比存在非常显著性差异（P＜0.001）。PTB 在20、200、2000 ng/ml 浓度下的细胞存活率分别为(46.08±4.91) %、(52.90±6.85) %、(61.09±3.53) %，各浓度组相对于OGD 组均有显著性差异（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）。
表5 PTB 对常压缺氧的PC12 细胞损伤存活率的影响( ±s)
表5 PTB 对常压缺氧的PC12 细胞损伤存活率的影响( ±s)
组别 样本数（个） 给药剂量（ng/ml） 存活率（%）空白组 3 - 100.00±3.01模型组 3 - 37.26±3.80###PTB低剂量组 3 20 46.08±4.91**PTB中剂量组 3 200 52.90±6.85***PTB高剂量组 3 2000 61.09±3.53***
缺氧条件下，由于ATP 代谢障碍、机体代谢增强、体内Ca2+浓度增加等原因，产生过量的氧自由基。氧自由基通过损伤生物膜、蛋白质、DNA 和糖分子，影响细胞信号传导和细胞凋亡，对机体产生损伤[14-15]。
课题组前期通过建立减压缺氧模型，测定实验动物存活率、血糖、肝糖原、肌糖原、ATP、乳酸（LD）、LDH 等指标，论证了PTB 具有维持血糖稳定，提高机体主要脏器中的糖原以及ATP 的含量，减少LD 积蓄以及LDH 的活性，改善机体能量代谢的作用[13]。本论文采用常压缺氧模型进一步检测了在缺氧条件下，PTB 对实验动物体内SOD、GSH、LDH 活性、MDA 含量、脑组织病理改变、对OGD 处理后细胞存活状态等指标的影响，进一步完善了其对缺氧实验动物的保护作用。SOD 被认为是抗氧化系统的第一道防线，是一种能够专一清除氧自由基的酶。它通过降低氧化活性部位金属离子的活性，以两步快速反应使转变为H2O2和O2。H2O2再被过氧化氢酶还原成H2O[16-17]。GSH 是一种非酶性抗氧化剂，通过其巯基氧化-还原态的转换，作为可逆的供氢体，和过氧化物及自由基结合，保护细胞膜中含巯基的蛋白质不被破坏[18]。在本实验中，PTB 在低、中、高3 个剂量下，均能显著增强缺氧小鼠心、脑组织中SOD、GSH 的活性，提高机体清除氧自由基的能力，减轻缺氧损伤。
脂质过氧化物（LPO）是人体内多聚不饱和脂肪酸和氧自由基结合后形成的。在缺氧条件下，LPO水平升高，机体细胞及细胞膜产生氧化反应，溶解细胞膜表面的磷脂，破坏细胞膜的生理结构[19]。LPO 还能和细胞内的DNA、脂质、蛋白质形成复合物，刺激新陈代谢改变，导致细胞内信号传导的紊乱、功能障碍，甚至凋亡。MDA 是LPO 稳定的终产物[20]。LDH 是生物体内氧化还原的重要酶系之一，它能可逆地催化乳酸氧化为丙酮酸。当机体缺氧时，主要参与葡萄糖的无氧代谢。LDH 活性的升高是机体无氧酵解程度升高的重要提示之一[21]。在本实验中，PTB 中、高剂量组小鼠的血清LDH含量较模型组相比明显降低，说明中、高剂量组小鼠的无氧酵解相对较少，反应出机体缺氧程度较轻。低、中剂量组小鼠的MDA 含量较模型组相比明显降低，说明小鼠体内发生脂质过氧化反应相对较低。这说明PTB 可以抑制缺氧条件下机体的脂质过氧化反应，改善机体缺氧程度。
行为学实验结果显示，PTB 在各剂量下均可延长常压缺氧小鼠在密闭空间下的存活时间。脑组织HE 染色和尼氏染色表明，PTB 具有保护神经细胞，维持细胞形态及功能的作用。体外实验结果表明，PTB 在20、200、2000 ng/ml 浓度下均能够提高OGD 诱导的PC12 细胞损伤存活率，存在一定的剂量依赖性，说明PTB 对神经细胞的损伤具有保护作用。
综上所述，蜂斗菜总内酯具有明显的提高小鼠耐缺氧能力的作用，其作用机制可能与清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应、保护神经细胞结构和功能有关。相比于藏药红景天，蜂斗菜总内脂的用药量明显减少，可作为抗缺氧的天然药物，进一步研究其作用的通路机制。
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