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邱 辉,刘学敏
中国医科大学附属盛京医院(辽宁 沈阳 110004)
妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)以葡萄糖不耐受为特征,导致妊娠期糖尿病控制不良,在世界范围内普遍存在,是妊娠期最常见的糖代谢异常类型之一,严重威胁母婴健康[1]。肥胖、不良饮食、微量营养素缺乏、产妇年龄提前、胰岛素抵抗以及糖尿病家族史等都是GDM发生的危险因素[2]。近年来,研究表明,长链非编码RNA在GDM的发生发展过程中扮演着重要角色[3-4]。
母系表达基因 3(Maternally expressed gene 3,MEG3)定位于人类染色体14q32.3,与肿瘤的发生发展等多种生物进程密切相关,其表达水平异常可影响机体细胞的代谢进程[5],但是其在GDM中的研究报道还较少,本研究通过检测 GDM 孕妇胎盘中MEG3的表达水平,分析其与 GDM孕妇临床特征的相关性,为探讨MEG3在妊娠糖尿病患者中的意义提供实验基础。
1.1对象和分组 收集2016年1月至2018年12月期间于我院妊娠的36～42周人胎盘组织。共纳入30例妊娠期糖尿病患者(GDM组,n=30),年龄23～45岁,平均(28±6.28)岁,孕周36～42周,平均(27.92±5.57)周。30例正常妊娠孕妇(对照组,n=30),年龄25～43岁,平均(27±8.28)岁,孕周36～41周,平均(38.46±2.08)周,从上述两组获取1cm3的胎盘组织,保存在液氮中备用。所有病例签署知情同意书,此研究获得本院伦理委员会批准。
有以下情况被排除：血脂异常、高血压、心脏病和慢性病肝肾疾病者;患有其他内分泌疾病,包括甲状腺疾病、肾上腺皮质疾病、肥胖骨质疏松症等;多胎分娩。孕妇于孕中期(24～28孕周),空腹血糖(FPG)≥5.1mmol/L,诊断为GDM;FPG≤4.4mmol/L者排除GDM。FPG≥4.4mmol/L但≤5.1mmol/L的孕妇进行75g口服葡萄糖耐量试验(OGTT),在此类病例中,当至少有1个糖值升高(FPG≥5.1mmol/L,1h OGTT≥10.0mmol/L或 2h OGTT≥8.5mmol/L)时,诊断为GDM。
追踪受试者孕晚期至分娩期间的临床特征,包括BMI、新生儿体重、胎盘重量等。
1.2材料和试剂 RNAiso Plus试剂盒、Prime ScriptTMRT reagent试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购至日本Takara。
1.3胎盘RNA提取 胎盘称量,在液氮中研磨成粉末状,加入RNAiso液,充分溶解后转移至1.5ml离心管中,室温静置5分钟,12000×g,4℃离心 5 分钟。吸上清液移到新的1.5ml离心管中,加入氯仿,颠倒混匀,室温静置10分钟。12000×g,4℃离心20分钟,吸上清至新1.5ml离心管中,向上清中加入等体积异丙醇,充分混匀后,-20℃静置10 分钟。12000×g,4℃离心10分钟,弃上清,加入75%乙醇1ml,上下颠倒,12000×g,4℃离心10分钟。弃上清,待离心管内干燥后,加50μl的 RNase-free 水溶解,使用Nanodrop 2000检测RNA浓度和纯度,取A260/A280比值在1.8～2.2之间,浓度大于300ng/μl的样本进行实验。
1.4反转录及实时定量PCR 取1μg RNA样品进行反转录,反转录后取2μl cDNA 进行qRT-PCR检测,反应条件为:95℃预变性30sec,95℃ 10sec,60℃ 40sec,40个循环,采用2-△△ct法进行分析lncRNA MEG3的相对表达量。引物序列如下：
lncRNA MEG3 F:5′-CCTGCTGCCCATCTACACCTC-3′,
lncRNA MEG3 R:5′-CCTCTTCATCCTTTGCCATCCTGG -3′。
GAPDH F:5′- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,
GAPDH R:5′- GAAGATGGTGATGGGATTT-3′。
1.5统计学方法 采用软件Graphpad prism8进行统计分析和作图,数据以平均值±标准差表示,组间分析使用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1LncRNA MEG3在GMD孕妇胎盘组织中高表达 应用实时定量PCR方法检测两组孕妇胎盘组织中MEG3的表达,结果显示,与对照组相比,GDM组患者孕妇胎盘组织中MEG3表达增高(P<0.05),见图1。
图1 qRT-PCR检测两组孕妇胎盘组织中MEG3的表达注：*与Control组比较,P<0.05
2.2胎盘组织MEG3表达与妊娠期糖尿病患者临床特征的关系 通过统计软件分析MEG3表达水平与临床指征间的相关性,结果显示,MEG3表达与孕妇年龄、产次、孕周无统计学差异,P>0.05,与孕妇BMI、新生儿体重、胎盘重量及不良事件有关(P<0.05),见表1。
表1 胎盘MEG3表达与妊娠期糖尿病患者临床特征的关系
GDM是指妊娠期发生或首次发现的糖代谢异常,患者在妊娠期发生慢性高血糖,在大多数情况下,这种高血糖是由于慢性胰岛素抵抗,胰腺β细胞的功能障碍导致糖耐量受损[6]。GDM的发病率逐年升高,对母婴的健康造成危害,超过一半的GDM孕妇在产后5年发生糖耐量异常,甚至发展为2型糖尿病,而子代也有较大的糖尿病患病风险[7]。
近年来,在GDM中具有诊断、预后和治疗用途的新标记物被研究的越来越多,包括microRNAs、长链非编码RNA和环状RNA在内的非编码RNA表达失调在GDM的发生过程中发挥重要的作用,其表达异常在多种病理环境中被报道。胎盘相关非编码RNA的异常表达与GDM的关键病理生理特点、胰岛素抵抗和β细胞功能障碍有关[8-9]。lncRNA MEG3作为一种抑癌基因被广泛研究,参与胃癌、甲状腺癌、膀胱癌等众多肿瘤的生物学进程[10]。研究显示,MEG3在胎盘中表达,与14号染色体单亲二体综合征的发生密切相关[11]。lncRNA MEG3异常表达还与滋养层细胞的迁移和凋亡密切相关,并影响胎盘中NF-κB、Caspase-3 和Bax蛋白的表达,而MEG3在严重子痫前期胎盘中表达降低,提示子痫前期的发生可能与 MEG3 低表达有关[12]。MEG3在GDM人脐静脉内皮细胞中高表达,通过PI3K信号转导通路靶向损伤胎儿内皮功能[13]。MEG3过表达能够抑制人绒毛滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖、迁徙和侵袭,并诱发凋亡[14],这些研究结果提示MEG3可能参与GDM的发生过程,并发挥重要的作用。
本研究采用实时荧光定量PCR方法检测30例GDM患者和30例正常妊娠孕妇的胎盘组织中MEG3的表达,发现与对照组相比,MEG3在GDM组患者胎盘组织中表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05);进一步分析MEG3的表达及与GDM患者临床特征的关系,发现MEG3表达水平与GDM 组孕妇BMI、新生儿体重、胎盘重量及不良事件有关,与孕妇年龄、产次、孕周无统计学差异。
综述所述,lncRNA MEG3在妊娠期糖尿病患者胎盘组织中高表达,表达水平与GDM患者临床特征关系密切。
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