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向立丽，王 倩，蒙延娜，付春梅，段雅雅，冯 凯，李晓林
(徐州市中心医院血液科，江苏 徐州 221009)
植入综合征(ES) 是造血干细胞移植(HSCT) 后中性粒细胞恢复早期的并发症，是伴有免疫因素参与的一组临床综合征[1]。其临床特征表现为发热、皮疹、非心源性肺水肿、毛细血管渗漏综合征、肝肾功能损害、体重增加等[1-2]。随着异基因 HSCT的广泛实施，ES 发生率升高至20%～68%[3-4]。研究发现，有多种血清细胞因子参与ES发病过程，其中包括白细胞介素-2(IL-2)、IL-6、IL-8、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，但这些因子在急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发病机制中也起着重要的作用[5-7]，目前，尚缺乏确切的血浆生物学标志物可用于ES的早期诊断和疗效评估。本研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HSCT患者的血浆中多种细胞因子的变化，分析出ES患者特征性改变的细胞因子IL-4、IL-17，为早期快速判断ES提供依据。
1.1研究对象 选取2017—2020年本科住院行异基因HSCT患者38例为研究组，年龄大于18～<68岁，包括急性白血病(AL)20例，骨髓增生异常综合征(MDS)7例，重型再生障碍性贫血(SAA)11例。同时选取健康者20例为对照组。
1.2方法
1.2.1预处理方案 研究组AL患者采用白消安(Bu)+环磷酰胺(Cy)+抗胸腺细胞球蛋白(ATG)或依托泊苷(VP-16)+Bu+Cy+ATG方案治疗，MDS患者采用地西他滨+Bu+Cy+ATG方案治疗，SAA患者采用氟达拉滨(Flu)+Cy+ATG方案治疗。对发生ES的患者，停用细胞生长因子，给予糖皮质激素治疗[甲泼尼龙1～2 mg/(kg·d)，在症状好转后迅速减量]，较重者辅以补充白蛋白、羟乙基淀粉扩容及改善毛细血管通透性，并予利尿对症治疗。所有患者于移植前(回输干细胞前)、移植后10 d及发生ES时、发生aGVHD时采集外周血血浆标本用于检测。发生ES的患者于治疗好转后再次采集外周血样本。收集对照组对象晨起空腹外周血血浆样本。两组标本采集时均获得患者知情同意。
1.2.2ES诊断标准[1]满足3条主要标准或2条主要标准加1条及以上次要标准确诊ES。(1)主要标准：①体温大于或等于38.5 ℃，无确定的感染灶；
②弥漫性肺浸润的非心源性肺水肿及缺氧症状；
③非药物性红斑性皮疹，累及全身皮肤25%以上。(2)次要标准：①体重增加大于或等于基础体重的2.5%；
②肾功能不全，肌酐大于或等于2倍基值以上；
③肝功能异常，总胆红素大于或等于34 μmol/L或转氨酶大于或等于2倍基值以上；
④不能用其他原因解释的一过性脑病。
1.2.3检测方法 检测前先将患者样本进行处理，按照ELISA试剂盒说明书完成工作液和标准液配置，向每个孔中加入 100 μL血浆样本和50 μL工作抗体，随后将平板密封并在摇床上室温孵育1 h。孵育完成后用wash buffer洗涤每个孔3次，最后1次洗涤后将平板翻转并在干净的吸水纸上扣去多余的液体。然后在每个孔中加入100 μL TMB底物，放在摇床上避光孵育10 min后立即加入100 μL 终止液终止显色反应，在摇床上晃动工作板 1 min 混合均匀后，立即使用酶标仪记录 450 nm处的光密度(OD)值，用于后续计算。人IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和IFN-α ELISA 试剂盒均购自英国Abcam公司，酶标仪型号为 SpectraMax Paradigm，购自美国 SpectraMax 公司。
2.1研究组患者HSCT后细胞因子水平变化 研究组38例患者HSCT后有9例发生ES，13例发生aGVHD，16例未发生ES及aGVHD。与aGVHD组、无ES及aGVHD组比较，发生ES组患者血浆IL-4、IL-17水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。其余细胞因子水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。
A.IL-4;B.IL-17;与无ES及aGVHD组、aGVHD组比较，aP<0.05。图1研究组患者HSCT后血浆IL-4和IL-17水平变化
2.2研究组患者HSCT前与对照组血浆IL-4、IL-17水平比较 与对照组比较，研究组患者移植前血浆IL-4水平[(5.19±0.62)pg/mLvs.(4.78±0.92)pg/mL]和IL-17水平[(11.37±1.24)pg/mLvs.(10.43±1.06)pg/mL]无明显升高，差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.3ES患者HSCT前后IL-4、IL-17水平变化 HSCT后，ES患者IL-4、IL-17水平较HSCT前显著升高，差异有统计学意义(P=0.012、0.009)。经过治疗好转后，ES患者IL-4、IL-17水平较发生ES时下降，差异有统计学意义(P=0.023、0.003)，与移植前比较，差异无统计学意义(P=0.168、0.483)，见表1。
表1 ES患者HSCT前后及治疗后IL-4、IL-17水平变化
2.4ES患者与无ES患者HSCT后10 d血浆IL-4、IL-17水平比较 9例患者发生ES(ES发生时间为12～20 d，持续时间为3～10 d)，16例患者未发生ES。与无ES组比较，ES组患者HSCT后10 d血浆IL-4、IL-17水平显著升高，差异均有统计学意义(P=0.016、0.005)，见表2。
表2 ES患者与无ES患者HSCT后10 d血浆IL-4、IL-17水平比较
2.5血浆IL-4、IL-17诊断ES的ROC曲线 通过比较未发生ES组与发生ES组HSCT后10 d的数据绘制ROC曲线，以ROC曲线及其曲线下面积作为某一诊断方法准确性评价的指标，ROC曲线下面积越大，诊断价值越高。IL-4诊断ES曲线下面积为(0.947±0.024)[95%置信区间(95%CI) 0.900～0.994，P<0.05]，特异度和敏感度分别为0.93%、0.72%，截点概率为1.750。IL-17诊断ES曲线下面积为(0.853±0.056)(95%CI0.799～0.912，P<0.05)，特异度和敏感度分别为0.83%、0.75%，截点概率为0.580。IL-4+IL-17诊断ES曲线下面积为(0.896±0.031)(95%CI0.875～0.929，P<0.05)，特异度和敏感度分别为0.90%、0.73%，截点概率为1.240。说明血浆IL-4和IL-17评估ES的诊断价值均高，而IL-4的诊断价值最高。见图2。
图2 血浆IL-4、IL-17诊断ES的ROC曲线
ES多发生在HSCT后4～22 d，白细胞升高5 d内[8-9]，伴随中性粒细胞恢复。目前独立于 GVHD发生的 ES 越来越常见[10]。在异基因HSCT中，ES与aGVHD临床表现相似，没有本质区别，目前主要从发生时间、临床特征、皮肤活检和细胞因子几方面进行鉴别[11]。LAWRENCE 等[12]报道HSCT后发生ES提示预后差。因此，早期快速识别ES并及时干预治疗有助于改善患者预后。血浆细胞因子水平检测方便快捷、耗时短，并且能随时动态监测其变化，可鉴别诊断ES和aGVHD，对ES早期诊断及疗效评估具有临床应用价值，而目前与ES相关的特异性细胞因子尚缺乏报道。SHAN等[13]研究了儿童干细胞移植后ES中降钙素原(PCT)和细胞因子变化，结果显示PCT升高可作为ES的生物标志物。KHANDELWAL等[14]对儿童HSCT受者发生ES时细胞因子谱进行了分析，发现与单独aGVHD患者相比，单独ES患者的血浆IL-1β、IL-6、IL-12、IL-4和IL-13水平显著升高。本研究首先对38例接受异基因HSCT患者进行了包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和IFN-α 在内的12种细胞因子检测，结果显示9例发生ES患者的血浆IL-4和IL-17水平较发生aGVHD、未发生ES及aGVHD患者显著升高，与无ES组患者比较，ES发生前即出现血浆IL-4和IL-17的水平升高，表明血浆IL-4和IL-17水平可作为ES的预测和诊断标志物。同时作者对IL-4和IL-17在ES患者中的诊断价值进行了评估。本研究中9例发生ES的患者临床症状多出现在HSCT后12～20 d，而HSCT后10 d，ES组和无ES组血浆IL-4、IL-17水平均具有显著差异。对血浆中IL-4、IL-17的水平进行ROC曲线分析，IL-4诊断ES曲线下面积为(0.947±0.024)，特异度为0.93%，敏感度为0.72%；
IL-17诊断ES曲线下面积为(0.853±0.056)，特异度为0.83%，敏感度为0.75%；
IL-4+IL-17诊断ES曲线下面积为(0.896±0.031)，特异度为0.90%，敏感度为0.73%。说明IL-4和IL-17可以作为ES的诊断性指标，而IL-4诊断价值最高，但是IL-4+IL-17联合诊断价值没有单项IL-4指标有优势，考虑可能与IL-17的诊断价值偏低有关。
综上所述，血浆IL-4、IL-17水平对评估ES具有较高的预测和早期诊断价值，为及时干预治疗并改善患者预后提供依据。本研究病例数较少，但仍具有参考意义，可在临床广泛开展应用。
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