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李汶航 张 睿 崔欣怡 唐佐青 油红捷 杨 铮 付修文 马 赟 刘文兰
(1 首都医科大学中医药学院，北京，100069；
2 首都医科大学基础医学院，100069，北京)
大量实验研究证实，骨髓干细胞(Bone Marrow Stem Cells，BMSCs)具有治疗肝纤维化的作用，其治疗机制与抑制肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)活化有关[1-3]。文献报道Rho三磷酸鸟苷酶(Rho GTPases)可参与多种生物学行为与功能，其中RhoA/ROCK1信号通路与HSCs活化相关，并参与肝纤维化的形成过程[4]。本课题组前期研究发现一贯煎可促进BMSCs募集到肝脏并发挥抗肝纤维化的作用，但具体的治疗机制尚未探明。本实验将进一步研究一贯煎联合BMSCs通过调控RhoA/ROCK1通路治疗肝纤维化的作用机制。
1.1 材料
1.1.1 动物 6周龄Sprague-Dawlay大鼠，雄性，体质量(200±20)g，共72只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006，伦理号：AEEI-2015-123，饲养于中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级动物室。
1.1.2 药物 一贯煎组成：北沙参9 g、麦冬9 g、当归9 g、生地黄20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，购自北京同仁堂药店。
一贯煎冻干粉制备方法[5-6]：取适宜煎煮容器，加药材量7倍的冷水浸泡1 h，煮沸20 min，滤出药液。随后药渣添加3倍量的水煎煮，煮沸30 min，取前后2次滤液合并、浓缩。将药液静置过夜。加入无水乙醇至70%，待析出沉淀后，过滤，滤液旋转蒸发至无醇味，加入10%甘露醇，于-80 ℃条件下冻存4 h后放入冷冻干燥机冻干48 h以上，待水分全部冻干，研磨粉碎，放入-20 ℃冰箱保存，将所得的冻干粉称重，计算出大鼠给药剂量：高剂量为0.44 g/100 g、中剂量为0.22 g/100 g、低剂量为0.11 g/100 g。
1.1.3 试剂与仪器 秋水仙碱(Colchicine，西双版纳药业有限责任公司，批号：200101)；
橄榄油(迈萨维诺特级初榨橄榄油，希腊，批号：67519)；
四氯化碳(CCl4，纯度≥99.0%，上海易恩化学技术有限公司，批号：206848)；
PVDF膜(罗氏公司，德国，批号：03010040001)；
RIPA蛋白裂解液(兰博利德，批号:1090121810)二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天公司，批号：010719190828)；
动物组织总RNA提取试剂盒(北京普洛麦格生物公司，批号：0000343931)；
SYBR Green Qpcr Master Mix(武汉赛维尔生物，批号：MPC2011005)。抗体RhoA(CST公司，美国，货号：2117S)；
Rho相关激酶1(Rho-associated kinase 1，ROCK1)(CST公司，美国，货号：4035S)；
α-SMA(CST公司，美国，货号：19245S)；
胶原蛋白-1(Collagen I，COL-1)(CST公司，美国，货号：91144S)，GAPDH(CST公司，美国，货号：5174S)。
电子天平(Sartorius公司，德国，型号：TE1502S)；
冷冻干燥机(CHRIST公司，德国，型号：ALPHA1-2Ldplus)；
正置荧光显微镜(Leica公司，德国，型号：DM4000B)；
旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-5298A)；
全自动多功能酶标仪(Thermo公司，美国，型号：MULTISKAN MK3)；
电泳仪(BioRad公司，美国，型号：1659001)；
成像系统(Fujifilm株式会社，日本，型号：LAS3000)；
低温离心机(Sigma公司，美国，型号：4-16S/4-16KS)；
分光光度计(Thermo公司，美国，型号：NANODROP 2000)；
PCR仪(BioRad公司，美国，型号：CFX96)；
全自动生化仪(日立公司，日本，型号：7600)。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 大鼠适应性饲养1周后随机分为8组，即正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组、一贯煎高剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎低剂量组、干细胞组、一贯煎+干细胞组，每组9只。肝纤维化模型构建：除正常对照组外，其余7组大鼠腹腔注射四氯化碳溶液(橄榄油、四氯化碳按1∶1配制)，初始2周注射剂量为0.2 mL/100 g，2次/周；
随后2周调整剂量为0.1 mL/100 g，2次/周；
最后2周调整剂量为0.05 mL/100 g，2次/周。正常对照组注射等量的橄榄油溶液。
BMSCs的分离、培养：取6周龄雄性SD大鼠，脱颈处死，于超净工作台中取下肢长骨，用完全培养基多次冲洗骨髓腔，过滤。将所得细胞放于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，当细胞浓度达到70%～80%后进行传代。当传至第4代时，消化、收集细胞、调整浓度为5×106个/L。
1.2.2 给药方法 干细胞组、一贯煎+干细胞组大鼠经尾静脉注射0.2 mL BMSCs；
其他组注射等量生理盐水。一贯煎高剂量组以一贯煎冻干粉[4.4 g/(kg·d)]灌胃治疗，一贯煎中剂量组、一贯煎+干细胞组以一贯煎冻干粉[2.2 g/(kg·d)]灌胃治疗，一贯煎低剂量组以一贯煎冻干粉[1.1 g/(kg·d)]灌胃治疗。秋水仙碱组以秋水仙碱[0.25 mg/(kg·d)]灌胃治疗，连续4周。正常对照组、模型对照组和干细胞组以等量蒸馏水灌胃。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 阴虚表征观测 于取材前测量大鼠体质量、饮水量、舌面干湿度，记录粪便、尿液情况，并对二便情况进行评分。大便正常干为1分，较干2分，干3分；
小便清为1分，小便白淡黄为2分，黄为3分。
1.2.3.2 组织收集方法 0.1 mL/100 g戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉大鼠，固定并腹主动脉采血，所得血液室温静置4 h。使用低温离心机离心10 min，离心半径14.5 cm。离心后分离上清待测。分离肝脏，取肝左叶的相同部位，放于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋。剩余肝组织分装冻存管，液氮冻存后放入-80 ℃冰箱保存。
1.2.3.3 血清生化检测 使用日立7600全自动生化仪检测各组血清谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase，GPT)、谷草转氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase，GOT)含量。
1.2.3.4 苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)、Masson染色观察肝组织病理改变 取石蜡包埋好组织切片，厚度5 μm，以HE染色后，使用光学显微镜观察肝组织炎症情况；
另取组织切片以Masson染色，观察组织中胶原纤维情况。
1.2.3.5 实时PCR法检测RhoA、ROCK、α-SMA、COL-1 mRNA的表达 使用RNA试剂盒提取总RNA后，将其逆转录成cDNA，完成后对其进行PCR扩增反应。引物序列见表1。
表1 引物序列
1.2.3.6 蛋白质印迹法检测RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的蛋白表达 取各组大鼠肝组织40 mg，提取总蛋白，以BCA法定量，每组取30 μg/泳道SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，脱脂牛奶封闭1 h。放入按1∶1 000稀释的一抗中孵育过夜，洗涤缓冲液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗涤3次，室温下以1∶10 000稀释的二抗孵育1 h，检测各组RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1蛋白表达，以GAPDH作为内参。
1.2.3.7 免疫组织化学检测α-SMA、COL-1的阳性表达面积 石蜡切片脱蜡复水，磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)漂洗、枸橼酸钠抗原修复液加热进行抗原修复。封闭，滴加按1∶200稀释的α-SMA、COL-1一抗液，4 ℃湿盒过夜；
次日漂洗、加入二抗，二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。
2.1 阴虚表征结果 与正常对照组比较，模型对照组大鼠体质量明显减轻、舌面干湿度显著降低、饮水减少，并出现大便干、小便黄等症状，差异均有统计学意义(均P<0.05)，提示模型对照组大鼠出现明显阴虚症状；
与模型对照组比较，一贯煎高剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎低剂量组、干细胞组、一贯煎+干细胞组体质量、饮水量和舌面干湿度增加，血流速度减缓，大便正常、小便淡黄，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。
表2 各组大鼠阴虚表征比较
2.2 肝功能检测结果 肝功能检测结果显示，模型对照组血清GPT、GOT含量较正常对照组显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，提示造模成功。一贯煎高剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎低剂量组、一贯煎+干细胞组血清GPT、GOT含量较模型对照组显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。
2.3 HE、Masson染色结果 与正常对照组比较，模型对照组的肝组织发生显著的坏死和肝纤维改变，肝小叶内有纤维间隔形成，肝小叶结构紊乱；
与模型对照组比较，一贯煎高剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎低剂量组、干细胞组、一贯煎+干细胞组肝组织的炎症坏死和纤维化程度均明显减轻。见表3、图1。
表3 各组大鼠肝功能与肝脏病理比较
图1 各组大鼠肝组织病理学(上HE、下Masson染色，×200)
2.4 实时PCR检测结果 PCR实验结果显示，与正常对照组比较，模型对照组RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA的表达显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；
与模型对照组比较，一贯煎高剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎+干细胞组的RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA的表达显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；
与BMSCs组比较，一贯煎+干细胞组的RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA的表达显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图2。
图2 各组大鼠RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1 mRNA表达
2.5 蛋白质印迹法检测结果 蛋白质印迹法检测结果显示，与正常对照组比较，模型对照组的RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1蛋白表达均显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；
与模型对照组比较，一贯煎高剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎低剂量组、干细胞组、一贯煎+干细胞组RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的蛋白表达均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且表达水平随一贯煎的给药剂量升高而降低；
与干细胞组比较，一贯煎+干细胞组RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的蛋白表达均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；
与一贯煎中剂量组比较，一贯煎+干细胞组的ROCK1、α-SMA表达均显著低于一贯煎中剂量组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图3。
2.4 免疫组织化学染色结果 肝组织免疫组织化学染色显示，与正常对照组比较，模型对照组肝组织切片的α-SMA、COL-1阳性面积显著增加，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与模型对照组比较，一贯煎高剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎低剂量组、干细胞组、一贯煎+干细胞组中α-SMA、COL-1的阳性面积显著减少，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图4。
图4 各组大鼠α-SMA、COL-1比较(免疫组织化学染色，400)
肝纤维化在中医无明确名称，临床中常根据患者的实际症状和体征将其归于“腹胀”“癥积”“胁痛”病证进行辨证治疗。肝纤维化主要由细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)不断积累引起，ECM主要由活化的HSCs产生，故HSCs的活化和增殖是肝纤维化进展过程中的重要环节[7-8]。一贯煎临床常用于治疗证属肝肾阴虚的肝纤维化、慢性肝炎、肝损伤等疾病。体外实验研究发现，一贯煎可抑制地活化和增殖达到抗纤维化的作用[9-10]。
BMSCs来源于骨髓，具有自我更新、增殖、多能分化和低抗原性等特点，故常用BMSCs移植进行肝病治疗研究[1-13]。目前，已有临床研究应用BMSCs治疗肝脏疾病并取得了良好效果[14-16]。但有研究发现，注射BMSCs后对肝纤维化的改善效果并不理想，其具体原因尚不明确，定向引导BMSCs移动到受损肝脏并持续发挥治疗作用是当前研究的重要内容[7]。本课题组前期实验证明一贯煎可促进BMSCs迁移到肝损伤部位，并发挥抗肝纤维化的作用，但其中具体机制还未探明[8-19]。
Rho通路在调控细胞功能方面有重要作用，可调节细胞迁移、收缩、活化等生理活动[20]。RhoA是Rho信号通路的启动子，参与肌动蛋白应力纤维的组装；
ROCK1是RhoA的下游分子，可被RhoA信号激活，从而参与HSCs活化与变形等生理过程[4]。RhoA/ROCK1激活后可引起HSCs活化，高表达α-SMA并分泌大量胶原，其中Collagen Ⅰ是肝纤维化过程中的重要因子，且肝脏的纤维化程度与肝组织中CollagenⅠ的沉积量正相关，故α-SMA、CollagenⅠ常作为肝纤维化严重程度的评价指标[21-24]。本研究实时PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，模型对照组RhoA、ROCK1、α-SMA、COL-1的mRNA和蛋白表达水平升高，RhoA/ROCK1通路激活，HSCs活化，并产生大量胶原。而一贯煎、干细胞和一贯煎+干细胞等干预方式均可抑制RhoA/ROCK1通路激活，阻止HSCs活化从而减少胶原产生，其中一贯煎联合BMSCs的作用效果优于一贯煎(中剂量)组和干细胞组(P<0.05)。
本实验结果表明：一贯煎与BMSCs可抑制Rho通路的关键分子RhoA、ROCK1的表达从而抑制HSCs活化，二者联合干预作用优于各自单独使用时的效果，本研究为进一步探索一贯煎促进BMSCs抗纤维化提供了基础。
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