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谢琰琰 王国磊
肺曲霉菌病(pulmonary aspergillosis,PA)又称为肺曲霉菌感染,主要是指肺曲霉菌侵袭肺部而引发的肺部疾病,其临床表现为咳嗽、咯血、发热、气短等,严重者还会由于肺功能损伤、免疫力降低等因素引发器官功能衰竭［1］。临床依据发病部位、侵袭情况以及宿主免疫状态将PA 分为寄生性肺曲霉菌病(parasitic pulmonary aspergillosis,PPA)、过敏性肺曲霉菌病(allergic pulmonary aspergillosis,APA) 和侵袭性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)3 种 亚 型。PA 患者通常需要接受抗真菌药物治疗,因而在治疗前应给予患者较为准确的微生物检验,对患者的疾病类型进行鉴别诊断［2］。本研究主要给予PA 患者GM 试验、G 试验以及痰培养,探究微生物检验在PA 患者临床诊治中的应用效果,报告如下。
1.1 一般资料 选择本院2020 年6 月～2022 年5 月收治的152 例PA 患者作为研究对象,所有患者均经组织病理切片检查确诊为PA,其中PPA 患者63 例,APA 患者57 例,IPA 患者32 例。PPA 患者中男37 例,女26 例；
年龄21～71 岁,平均年龄(46.84±3.51)岁。APA 患者中男34 例,女23 例；
年龄20～73 岁,平均年龄(47.11±3.45)岁。IPA 患者中男18 例,女14 例；
年龄21～66 岁,平均年龄(46.75±3.36)岁。本研究经伦理委员会核批,且患者及其家属对本次研究知情并签署知情同意书。
1.2 纳入标准 ①住院时间≥5 d；
②体温＞38.3℃；
③患者存在不同程度的呼吸道感染症状；
④胸部影像学检测发现符合曲霉菌感染特征；
⑤同意纤维支气管镜下取肺泡灌洗液进行GM 检测及肺组织活检；
⑥临床资料完整；
⑦精神状态良好,具备较高的检测依从性。
1.3 排除标准 ①年龄≤18 岁；
②入院1 周内接受股沟抗真菌治疗或是正在使用半合成青霉素；
③合并其他部位真菌感染或其他呼吸系统疾病；
④使用高剂量激素；
⑤接受透析治疗；
⑥输注白蛋白或球蛋白；
⑦化疗后存在严重黏膜炎患者。
1.4 方法 所有患者均采用GM 试验、G 试验以及痰培养检测法进行检测。
1.4.1 GM 试验 ①试剂及仪器：GM 试剂盒(北海市兴龙生物制品有限公司)、全自动化学发光酶免分析仪(天津喜诺有限公司有限公司)、低温高速台式离心机(北京白洋医疗器械有限公司)、漩涡震荡仪(上海康禾光电仪器有限公司)、4℃/-20℃电冰箱(海尔集团公司)。②检测过程：于患者入院后为其进行常规禁水禁食,并于第2 天采集空腹静脉血,置入高速离心机中以3000 r/min 的速度进行10～15 min 的离心,取血清保存于2～8℃冰箱之中,2 h 内进行检测。严重溶血、黄疸、脂血的样本不给予检测。将GM 试剂盒取出于室温下进行温度平衡20 min,试剂条从密闭盒中取出,将样本仓和吸头仓封膜撕下后插入试剂槽中,整个过程不能让吸头跳出或者样本仓液体溅出。用1 ml 溶解液溶解质控品,并在漩涡仪震荡1 min,直到完全溶解后备用。将溶解后的质控品和样本血清分别吸300 μl依次加入样本仓里,并反复吸排6 次以上,加样过程中避免气泡产生,启动FASIC 测量流程进行反应,反应结束后检测系统自动计算出每个样本的半乳甘露聚糖浓度。半乳甘露聚糖浓度≥0.5 μg/L 则认为是半乳甘露聚糖阳性,则发生曲霉菌深部感染的风险高；
半乳甘露聚糖浓度＜0.25 μg/L 则认为是半乳甘露聚糖阴性,发生曲霉菌深部感染的风险低。
1.4.2 G 试验 ①试剂及仪器：真菌(1,3)-β-D 葡聚糖检测试剂盒(北京金山川科技发展有限公司,MB-T80)。②检测过程：于患者入院后为其进行常规禁水禁食,并于第2 天用专用试管采集空腹静脉血4 ml,放入高速离心机内,以3000 r/min 的速度进行10～15 min 离心,分离血浆后2 h 内进行检测。标本需要保存于2～8℃条件下,且保存时间≤24 h,运输过程应保障冷藏。取上述血清0.1 ml 加入0.9 ml 处理液之中混合均匀后于70℃条件下孵育10 min,取出后放置于冷却槽中冷却5 min。反应主剂溶液的配置主要依据如下原则：GKT-1M：无需复溶,GKT-2M、GKT-5M、GKT-10M、GKT-20M：分别取反应主剂溶液0.6、1.2、2.8、5.6 ml 混匀并静置代用,复溶后的试剂于2～8℃保存,并于30 min 内使用。将血清样本0.2 ml 加入酶反应主剂之中,溶解后通过微量加样器将其转移至9 mm×65 mm 标准无热源平底试管中,在此过程中应避免产生气泡,随后将其插入MB-80 微生物快速动态检测系统之中进行反应,反应结束后由检测系统自动计算出待检测的血清样本之中(1,3)-β-D 葡聚糖含量。
1.4.3 痰培养 为入院的PA 患者采集痰液做真菌培养以及涂片检查,采集过程中应严格遵循无菌操作。患者晨起后应用朵贝氏液及清水漱口,充分去除口腔中的细菌,然后由采集人员指导患者进行深呼吸,用力咳出气管深部的痰液至无菌容器之中,30 min 内送检。依据临床实验操作规程进行痰液培养,将样本接种于实验室标准沙保罗氏培养基和科玛嘉玉米显色培养基之中,经25℃孵育。对生长的菌落进行染色,并于显微镜下观察菌体的形态,经全自动微生物系统鉴定及药敏试验。涂片镜检：临床标本经过10%～20%的KOH 固定处理5～10 min 或革兰氏染色涂片后,直接用电子显微镜在高倍镜下观察菌丝、孢子。依据临床对深部真菌感染的诊断标准对其进行判断,将标本接种于沙保罗氏培养基和科玛嘉玉米显色培养基之后24～48 h,如若菌落呈孔状生长则记为阳性,如偏厚经染色后镜检,如若发现孢子及菌丝判定为阳性。
1.5 观察指标及判定标准 对比三种亚型患者不同检测方法阳性率及临床症状,分析三种亚型患者治疗措施及预后效果。①联合检验中GM 试验、G 试验、痰培养任意一项检验结果为阳性即记为阳性。②临床症状主要包括发热、咳嗽、咯血、胸闷、肺啰音等。③依据患者的实际情况给予手术、药物治疗,探究不同类型患者的治疗情况及预后效果。
1.6 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；
计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 三种亚型患者不同检测方法的阳性率对比PPA、APA、IPA 患者GM 试验的阳性率高于G 试验与痰培养,差异具有统计学意义(P＜0.05)；
且PPA、APA、IPA 患者联合检验的阳性率高于G 试验与痰培养,差异具有统计学意义(P＜0.05)。PPA、APA、IPA 患者联合检验的阳性率略高于GM 试验,但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。
表1 三种亚型患者不同检测方法的阳性率对比［n(%)］
2.2 三种亚型患者临床症状对比 PPA 患者症状多表现为咳嗽、咯血、胸闷,APA 患者症状多表现为咳嗽、咯血、胸闷、肺啰音,而IPA 患者症状多表现为发热、咳嗽、胸闷、肺啰音。IPA 患者的发热、咳嗽、胸闷、肺啰音发生率高于APA、PPA 患者,APA 患者的发热、咳嗽、胸闷、肺啰音发生率高于PPA 患者,PPA 患者咯血发生率高于APA、IPA 患者,APA 患者咯血发生率高于IPA 患者,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。
表2 三种亚型患者临床症状对比［n(%)］
2.3 三种亚型患者治疗措施及预后效果分析 PPA 患者85.71%采用手术治疗,APA 患者87.72%采用药物治疗,IPA 患者100.00%采用药物治疗。治疗后,三种亚型患者的治疗效果均较好,PPA 治愈率为95.24%,APA 治愈率为92.98%,IPA 治愈率为90.63%。见表3。
表3 三种亚型患者治疗措施及预后效果分析［n(%)］
PA 在临床重症患者之中高发,由于该类患者往往需要长期接受抗生素以及激素等药物治疗,导致免疫力降低,因而发病风险较高。PA 患者主要可以分为PPA、APA 以及IPA 三种亚型,PPA 发病较为隐匿,且症状缺少特异性,诊断较为困难；
APA 多与哮喘、慢性嗜酸粒细胞肺炎等进行鉴别；
IPA 则病情进展较为迅速,对患者的生命安全造成严重影响［3］。因而为了更好地保障临床针对性治疗措施的开展,需要通过微生物检验以及临床症状对患者疾病亚型进行分辨,选择适当的治疗方法以提升临床疗效［4］。
微生物检验作为以微生物学理论为基础,利用微生物试验技术研究微生物种类、性质、活动规律等的重要技术,在真菌感染性疾病的诊断中具有良好的应用价值［5］。本次研究对152 例PA 患者分别进行微生物检验——GM 试验、G 试验以及痰培养检测,结果发现,PPA、APA、IPA 患者GM 试验的阳性率高于G 试验与痰培养,差异具有统计学意义(P＜0.05)；
且PPA、APA、IPA 患者联合检验的阳性率高于G 试验与痰培养,差异具有统计学意义(P＜0.05)。PPA、APA、IPA 患者联合检验的阳性率略高于GM 试验,但差异无统计学意义(P＞0.05)。对其原因进行分析,主要是由于痰培养为微生物检验的基础措施,主要通过致病菌培养的措施对感染疾病的类型进行判断。G 试验通过对真菌细胞壁的主要成分特异性进行检验,从而判断患者真菌感染的情况,如若患者机体受到真菌深部侵袭,则会导致(1,3)-β-D 葡聚糖在体内释放,含量不断提升［6-9］。而GM 的主要检测成分为半乳甘露聚糖,该成分广泛存在于曲霉与青霉细胞壁之中,该指标的释放量与菌量呈正比,因而对其含量进行检测,能够更好地反映感染的程度,并通过对其的动态监测能够评估患者的临床治疗效果,并依据检测结果优化治疗方案,改善患者预后［10-13］。
同时本次研究对患者的症状进行分析,结果发现,PPA 患者症状多表现为咳嗽、咯血、胸闷,APA 患者症状多表现为咳嗽、咯血、胸闷、肺啰音,而IPA 患者症状多表现为发热、咳嗽、胸闷、肺啰音。IPA 患者的发热、咳嗽、胸闷、肺啰音发生率高于APA、PPA 患者,APA 患者的发热、咳嗽、胸闷、肺啰音发生率高于PPA 患者,PPA 患者咯血发生率高于APA、IPA 患者,APA 患者咯血发生率高于IPA 患者,差异有统计学意义(P＜0.05)。因而临床通过微生物检验的方法能够对三种PA 亚型进行鉴别诊断,为病情的评估提供更进一步的参考信息［14-16］。既往研究中开展涂片直接镜检,操作较为便捷,可更快速得出结果。但通常无法对真菌菌属进行区分。痰培养的应用能够对真菌均属进行区分,致病性真菌培养呈现阳性即可确诊,但对于条件致病性真菌,则需要进行连续2 次培养分离出同种曲霉菌才能够作出诊断。真菌感染会合并细菌感染,故在临床工作中需提高警惕,尽早作出诊断,避免误诊、漏诊。乳甘露聚糖同样是真菌细胞壁的主要成分,具有一定的抗原性,因而GM 试验对于早期诊断曲霉菌病有一定价值。开展GM 试验,同时可联合肺泡灌洗液培养,尽可能采取多种试验检测方法,提高肺曲霉菌的诊断率。真菌的抗原检测主要有(1,3)-β-D 葡聚糖及半乳甘露聚糖为真菌细胞壁的主要成分,其普遍存在于真菌属的细胞壁中,为所有酵母菌及丝状真菌细胞壁中特有的成分。对于BDG 的检测称为G 试验,可被用于肺曲霉菌病的早期诊断。
此外,不同PA 亚型患者的表现不同,也会使得临床治疗方案存在差异,其中PPA 患者主要是由于曲霉球绝大多数发生于原有的肺空洞内,形团块状肉芽肿性曲霉菌球,导致患者出现咯血症状,因而临床中主张应用手术治疗,其主要目的在于将肺部原发疾病和寄生性曲菌球切除,避免出血［17-19］。APA 是由曲霉引起的一种过敏性疾病,几乎仅由烟曲霉引起,主要表现有反复发作的哮喘症状,该类患者可经历3 个临床阶段：早期激素敏感性哮喘,中期激素依赖性哮喘,晚期肺纤维化、蜂窝肺［20］。因而该亚型早期通过药物治疗可阻止病情进展,晚期则需通过手术保障预后效果。IPA 临床上则主要采用抗真菌药的治疗方法,本研究中,PPA以手术为主,APA 以用药为主,IPA 患者则未经手术治疗,结果发现,三种亚型患者治疗效果均较好,PPA 治愈率为95.24%,APA 治愈率为92.98%,IPA 治愈率为90.63%。
总之,微生物检验方法联合应用能够更好地提升PA 患者的诊断率,并对患者进行亚型判断,从而确定后续治疗的开展。经治疗后各亚型患者均取得较好的预后效果,该微生物检验为临床疾病的诊断、鉴别诊断及治疗提供了较高的参考依据,值得广泛应用于临床。
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