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路岩莉，房艳艳，李新民，孙丹，韩耀巍，陈祖明
（1．天津中医药大学第一附属医院儿科，天津 300381；
2．国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381；
3．山东省临沂市中医医院儿科，临沂 276002）
神经元电压门控性钠离子通道（VGSC）在脑神经细胞动作电位的产生和传播中起重要作用，其功能异常与癫痫的发病机制密切相关[1]，如电流密度增加、稳态激活和失活分别向负值和正值转移、持续电流增强、失活恢复加快和快速失活延迟，从而使VGSC异常活化，导致癫痫发作。因此VGSC是多种抗癫痫发作药物的作用靶点，如卡马西平（CBZ）、奥卡西平（OXC）和拉莫三嗪（LEV）等[2]。中药复方制剂熄风胶囊是马融教授根据“益肾填精、豁痰息风”的治则研制而成，临床研究证实治疗癫痫有效[3]，而且与CBZ联合应用时疗效优于单药治疗，其机制之一可能是熄风胶囊通过降低癫痫大鼠多药耐药相关蛋白的表达[4]，从而提高CBZ在脑脊液的药物浓度[5]。前期实验研究发现减少VGSC表达，并抑制异常活化可能是熄风胶囊抗癫痫作用机制之一[6]。因此鉴于熄风胶囊和CBZ都可影响VGSC的电生理功能，本研究进一步探讨两者联合应用对VGSC的影响。
1.1 动物 选择110只雄性无特定病原体（SPF）级Sprague Dawley（SD）大鼠（军事医学科学院实验动物中心，许可证为SCXK-军2012-0004），体质量（45±10）g。
1.2 主要药品及仪器 熄风胶囊（每粒0．33 g；
成分主要包括紫河车、天麻、石菖蒲、僵蚕、全蝎、郁金、川芎、白金丸；
天津中医药大学第一附属医院杏林药厂，津Z0252）；
卡马西平片（商品名：得理多，每片0．2g，北京诺华制药有限公司，国药准字H11022279）；
氯化锂（每瓶100 g，美国Sigma-Aldrich公司，批号746460）、盐酸匹罗卡品（每瓶5g，美国Sigma-Aldrich公司，批号066k1730）、BX43手动显微镜系统（奥林巴斯北京销售服务有限公司）；
双通道EPC-10膜片钳放大器（德国HEKA公司）。
1.3 实验造模 将110只SD大鼠随机分为空白对照组20只，其余90只用于建立癫痫模型。先后腹腔注射127 mg/kg氯化锂和30 mg/kg匹罗卡品（先于2/3量，30 min后予剩余量），大鼠出现癫痫持续状态（SE）1 h后，予地西泮控制发作以减少病死率。
根据Racine的6级癫痫行为严重程度标准[7]，合格致痫大鼠模型为出现Ⅳ级以上痫性发作，且停止发作后状态良好者。模型大鼠在此后的观察过程中均出现了反复自发性发作（SRS）。
1.4 实验分组及处理 从造模成功的85只SD大鼠中随机选取80只分为4组，各20只。熄风胶囊治疗组（熄风组）：熄风胶囊0．66 g药粉溶于4 mL纯净水中；
CBZ治疗组（CBZ组）：CBZ 20 mg/kg溶于4mL纯净水中；
熄风胶囊+CBZ联合治疗组（熄卡组）：0．66 g药粉和BZ 20 mg/kg溶于4 mL纯净水中；
模型对照组和空白对照组：各4 mL生理盐水。每日早8：00 和晚 8：00 各灌胃 1 次，每次 2 mL，共 60 d。
1.5 动物行为监测 影像监控系统于开始给药后连续监测60 d，记录每组SRS次数，评定惊厥级别。每周统计分析1次。实验结束时，对所有数据进行统计分析。
1.6 免疫组化实验 分离大鼠海马组织并切片，脱蜡至水，磷酸缓冲液浸泡5 min；
放入柠檬酸-柠檬酸钠溶液中反应；
3%H2O2温育10 min；
山羊免疫正常血清温育30 min。用兔多克隆一抗（1∶25）孵育切片。用羊抗兔二抗孵育切片，磷酸缓冲液洗涤切片。先后滴加光谱纯试剂、二氨基联苯胺显色液显色、苏木精核复染。封片、拍照。采用Image-Pro Plus 6．0软件分析和计算平均阳性光密度值（OD）。
1.7 全细胞膜片钳记录 分离实验大鼠海马组织并切片；
加入蛋白酶消化；
放入盛有氧饱和标准细胞外液的离心管内，轻轻吹打，取上部细胞悬液加入灌注槽内，待细胞贴壁于盖玻片上，即进行检测，并记录峰值电流、半数稳态激活电压、半数稳态失活电压和失活后恢复时间常数（采样频率10 kHz，滤波频率 2．9 kHz）。
1.8 统计学分析 用SPSS 24统计软件包进行分析。所有实验数据采用均值±标准差（±s）描述，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用SNK检验。P＜0．05为差异有统计学意义。
2.1 实验大鼠行为学观察 氯化锂-匹罗卡品癫痫模型是目前比较理想的研究颞叶癫痫动物模型[8]，较好的模拟了癫痫发生和形成的全过程。本实验观察可见3期改变：1）急性期：大鼠出现Ⅳ级及以上发作，达到SE。本实验造模成功率为94．4%。2）静止期：SE后2 d到14 d，SRS较少后者没有。3）慢性期：SE 后 15～60 d，可观察到Ⅰ～Ⅲ级的 SRS，详见表1。空白对照组未见SRS，熄风组、熄卡组和CBZ组 SRS 次数均低于模型对照组（P＜0．01），提示治疗有效；
在各治疗组间，熄卡组SRS次数明显低于熄风组和 CBZ 组（P＜0．01），提示联合治疗优于单药，CBZ组 SRS次数明显低于熄风组（P＜0．01），提示CBZ组疗效优于熄风组。
表1 各组大鼠SRS次数（±s）Tab.1 SRS frequency of rats in each group（±s）
表1 各组大鼠SRS次数（±s）Tab.1 SRS frequency of rats in each group（±s）
注：与空白对照组比较，**P＜0．01；
与模型对照组比较，##P＜0．01；
与熄风组比较，△△P＜0．01。
组别 动物数 SRS发作（次数）空白对照组 20 0模型对照组 20 29．60±2．69**熄风组 20 17．07±2．40##熄卡组 20 9．67±1．11##△△CBZ 组 20 12．47±1．96##△△
2.2 免疫组织化法检测大鼠海马VGSC的表达 光镜（×200）下观察各组切片（见图1），发现实验各组海马CA3可见棕黄色颗粒状或者点状VGSC免疫反应物，而CA1区和DG区较少见。在CA3区，空白对照组可见神经元细胞分布较密集、均匀，胞体多呈棱锥形，VGSC广泛分布于胞核和胞浆；
模型对照组可见神经元棕黄色区域减少、变淡，分布不均，在神经元变性、坏死部位棕黄色变浅、消失，而在周围组织中棕黄色增强，提示出现VGSC上调。各治疗组中，各治疗组均可见少量神经元变性、坏死，熄卡组神经元变性、坏死数量模型少于熄风组和CBZ组；
相应的VGSC在神经元变性、坏死部位表达中，熄卡组多于熄风组和CBZ组，而在周围组织中VGSC上调现象熄卡组明显少于熄风组和CBZ组。
图1 VGSC在大鼠海马组织的分布（免疫组织化学染色，×200倍）Fig.1 Distribution of VGSC in rat hippocampus（immunohistochemical staining，×200 times）
表2可见，在CA3区，与空白对照组比较，模型对照组 VGSC 表达上调（P＜0．05）；
各治疗组较模型对照组 VGSC 表达均下调（P＜0．05），其中熄卡组明显低于熄风组和 CBZ 组（P＜0．05），而熄风组和 CBZ组组间差异无明显统计学意义（P＞0．05）。VGSC在各组CA1区和DG区表达变化不明显，与图1相对应。
表2 大鼠海马组织VGSC的表达（±s）Tab.2 Expression of VGSC in rat hippocampus（±s）
表2 大鼠海马组织VGSC的表达（±s）Tab.2 Expression of VGSC in rat hippocampus（±s）
注：与空白对照组比较，*P＜0．05；
与模型对照组比较，#P＜0．05；
与熄风组比较，△P＜0．05；
与熄卡组比较，▲P＜0．05。
组别 动物数 CA1区（OD） CA3区（OD） DG区（OD）空白对照组 10 0．210±0．000 0．210±0．000 0．210±0．000模型对照组 10 0．202±0．008 0．235±0．018* 0．213±0．003熄风组 10 0．210±0．001 0．212±0．002# 0．212±0．002熄卡组 10 0．217±0．002 0．152±0．019#△ 0．218±0．003 CBZ 组 10 0．218±0．004 0．215±0．003#▲ 0．217±0．005
2.3 实验大鼠海马神经元VGSC功能电生理学检测
2.3.1 峰值电流（nA） 由表3可见，各治疗组的峰值电流较模型对照组显著降低（P＜0．01），提示癫痫大鼠经治疗后钠离子内流减少。其中与熄风组和CBZ组相比，熄卡组的钠离子内流减少更加明显（P＜0．01），提示联合治疗优于单药治疗，而熄风组和CBZ 组组间差异无统计学意义（P＞0．05）。
表3 钠通道功能电生理学检测数据比较（±s）Tab.3 Comparison of electrophysiological detection data of sodium channel function（±s）
表3 钠通道功能电生理学检测数据比较（±s）Tab.3 Comparison of electrophysiological detection data of sodium channel function（±s）
注：与模型对照组比较，**P＜0．01；
与熄风组比较，##P＜0．01；
与熄卡组比较，△△P＜0．01。
组别动物数峰值电流（nA）半数稳态激活V1/2（μV）半数稳态失活V1/2（μV）失活后恢复时间常数（τ）空白对照组 10 -229．06±26．01 -55．11±2．06 -51．41±0．80 1．86±0．21模型对照组 10 -319．70±28．24 -58．95±1．97 -48．10±2．05 1．36±0．15熄风组 10 -225．13±31．70** -55．73±1．68** -53．09±1．87** 2．17±0．40**熄卡组 10 -183．17±8．96**## -55．18±1．70** -56．01±3．05**## 2．69±0．35**##CBZ 组 10 -243．74±32．05**△△ -55．24±1．61** -57．61±0．89**## 2．50±0．15**##
2.3.2 半数稳态激活电压V1/2（μV） 由表3可见，各治疗组的 V1/2较模型对照组上升（P＜0．01），提示癫痫大鼠经治疗后其半数稳态激活电压V1/2上升。其中，熄风组的半数稳态激活电压V1/2稍低于CBZ组，无统计学意义（P＞0．05）。与熄风组和 CBZ 组相比，熄卡组的半数稳态激活电压V1/2无统计学意义（P＞0．05）。
2.3.3 半数稳态失活电压V1/2（μV）由表3可见，各治疗组的半数稳态失活电压V1/2较模型对照组下降（P＜0．01），提示癫痫大鼠经治疗后其半数稳态失活电压V1/2下降。其中与熄风组相比，熄卡组和CBZ组的半数稳态失活电压 V1/2下降（P＜0．01）；
与 CBZ组相比，熄卡组的半数稳态失活电压V1/2稍高，无统计学意义（P＞0．05）。
2.3.4 失活后恢复时间常数（τ） 由表3可见，各治疗组的 τ明显延长，有显著性差异（P＜0．01），提示癫痫大鼠经治疗后其τ明显延长。其中与熄风组相比，熄卡组和CBZ组的τ延长，有统计学意义（P＜0．01）；
与CBZ组相比，熄卡组的τ无统计学意义（P＞0．05）。
马融教授认为癫痫发作频繁且病程较长者，其病机关键在于“肾精亏虚、痰瘀阻络”，治宜“益肾填精、豁痰熄风”[9]，因此组方熄风胶囊，前期临床和动物实验研究[3]证实控制癫痫发作有效，而影响VGSC电生理功能可能是其作用机制之一[6]。VGSC开放引起的去极化内向电流是动作电位产生和传递的基础，当癫痫发作使海马神经元细胞VGSC的表达或者功能发生变化时，出现癫痫反复发作[2]。此外，针对匹罗卡品癫痫模型的多项研究证实海马神经元VGSC对CBZ的敏感性下降[10]，可能是其产生耐药的机制之一[1]，而减少抗癫痫发作药物的耐药是目前研究的热点之一。因此，本研究根据既往研究发现熄风胶囊与CBZ联合应用时疗效优于单药治疗，且都可影响VGSC的电生理功能，进一步探讨两者的协同作用机制。
本实验发现VGSC的表达变化主要发生在CA3区，其中模型对照组神经元退变、坏死，VGSC染色减少甚至消失，而在周围正常组织中染色增强，提示出现VGSC上调，且在总体上VGSC表达水平上调超过损失，这与神经元再生导致海马苔藓纤维出芽（MFS）有关，后者导致神经元兴奋性增高，进而出现癫痫反复发作[11]。治疗组中熄卡组海马神经元损伤明显轻于熄风组和CBZ组，提示联合治疗优于单药治疗，而VGSC的表达水平均下调，与前期研究证实熄风胶囊和CBZ均可通过减轻海马神经元线粒体损伤和MFS相一致[12]；
与神经损伤相伴随的VGSC在神经元退变、坏死部位表达熄卡组多于熄风组和CBZ组，提示在前者治疗下病变区域VGSC存在较多，对治疗更加敏感；
而在变性、坏死的神经元周围的正常组织中VGSC上调现象熄卡组明显少于熄风组和CBZ组，提示在病变周围神经元再生导致VGSC上调现象与药物的治疗效果呈负相关；
如表2，在总体VGSC表达水平上，熄卡组明显低于熄风组和CBZ组，提示前者正常VGSC存在较多，而新生VGSC较少，故疗效优于后两者，提示正常VGSC较新生VGSC对抗癫痫药物治疗更敏感[2]。
本实验检测VGSC的电生理参数，发现治疗组的峰值电流较模型对照组显著下降，提示癫痫大鼠经熄风胶囊和/或CBZ治疗后钠离子内流减少，从而达到控制惊厥的目的。其中熄风胶囊和CBZ联合治疗优于单药治疗，其原因可能为两者的协同作用，或者主要是熄风胶囊增强了VGSC对CBZ的药物敏感性，这与熄风胶囊降低癫痫大鼠多药耐药相关蛋白的表达和分布[5]及提高CBZ在脑脊液的药物浓度[6]有关。
癫痫大鼠经治疗后其半数稳态激活电压V1/2上升，即癫痫激活阈值升高，不易被激活，从而达到控制惊厥的目的。其中与熄风组和CBZ组相比，熄卡组的半数稳态激活电压半数稳态激活电压V1/2有上升趋势，但无统计学意义，提示对半数稳态激活电压V1/2的影响不是熄风胶囊和CBZ联合治疗优于单药治疗的主要药理机制。癫痫大鼠经熄风胶囊和/或CBZ治疗后其半数稳态失活电压V1/2下降，即癫痫失活阈值下降，较易失活，从而达到控制惊厥的目的。其中与熄风组相比，熄卡组的半数稳态失活电压V1/2下降，有统计学意义；
与CBZ组相比，熄卡组的半数稳态失活电压V1/2稍高，但无统计学意义，提示对半数稳态失活电压V1/2的影响不是熄风胶囊和CBZ联合治疗优于单药治疗的主要药理机制。总之，各治疗组VGSC激活阈值上升、失活阈值下降，影响神经元兴奋性，从而达到控制癫痫的目的[2]，但是这不是熄风胶囊和CBZ联合治疗优于单药治疗的主要药理机制。
癫痫大鼠经治疗失活后恢复时间常数明显延长，不易被再次激活，从而抑制放电扩散以控制惊厥[6]。其中与熄风组相比，熄卡组的时间常数延长，有统计学意义；
与CBZ组相比，熄卡组的时间常数有延长趋势，无统计学意义，提示对失活后恢复时间常数的影响不是熄风胶囊和CBZ联合治疗优于单药治疗的主要药理机制。
本研究进一步证实熄风胶囊和CBZ均可以减少神经元坏死区域VGSC的损失和周围正常组织VGSC的表达上调，影响VGSC的电生理功能，从而控制癫痫发作，其中减少VGSC峰值电流是主要作用机制。单药治疗时，CBZ在影响VGSC的电生理功能方面均强于熄风胶囊，但无统计学意义；
两者联合应用疗效明显优于单药治疗，主要作用机制为减少VGSC峰值电流。本研究在前期基础上再次证实了中西药联合治疗癫痫的合理性，为进一步研究提供了理论基础。
