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张明威，陈 阳，王 静，葛京平，张春妮，汪俊军，王 成
（中国人民解放军东部战区总医院a．检验科；
b．泌尿外科，南京210002）
肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一种原发于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，其发病率居于泌尿系统恶性肿瘤第二位，死亡率居第一位，且仍呈现出明显增长趋势，防治形势极为严峻[1]。RCC的发病机制尚不明确，临床亦缺乏有价值的血清学标志物，因此，寻找和鉴定有价值的血清学标志物仍是诊治亟需解决的重要临床问题[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链小分子核糖核酸，与多种恶性肿瘤包括RCC 密切相关，在肿瘤的发生、发展中扮演着“原癌基因”和“抑癌基因”的双重角色。人外周血中也存在丰富、稳定表达的miRNA，RCC患者特定变化的miRNA 具备作为RCC 新型非侵入性分子标志物潜能。目前，已鉴定出多种在RCC患者外周血中显著变化的miRNA。miR-378定位于人5 号染色体（5 号染色体:149,732,825-149,732,890），报道显示其在RCC患者外周血中显著变化，但不同研究结果呈现出明显的不一致甚至相互矛盾，因此其变化趋势及临床价值仍有待进一步证实和探讨[3-6]。近年来研究显示，外周血循环miRNA 可包裹于细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），且EVs miRNA的检测较循环miRNA 更具价值[7]，但目前RCC患者外周血EVs中miR-378的变化及临床价值尚不清楚。同时，RCC 组织和EVs 中miR-378的表达变化或可为前期研究结果不一致提供新的线索。因此，本文针对RCC患者组织和外周血EVs 中miR-378的表达变化进行检测和分析，并对其功能进行生物信息学分析，以期初步明确患者外周血及外周血EVs 中miR-378 变化、价值及潜在的生物学功能。
1.1 研究对象 选取2014年1月～ 2018年12月在东部战区总医院泌尿外科初收并行肾癌根治术的RCC患者癌组织及对应的癌旁组织40 对，所有患者手术切除样本均进行病理学确诊并按照Furhman分级标准对肿瘤进行分级，其中Ⅰ级8 例、I～II级5 例、Ⅱ级16 例、II～III 级2 例、Ⅲ级3 例、Ⅳ级1 例及无法分级组织5 例；
同时，收集RCC患者（男性32 例，女性28 例，年龄57.4 ± 12.8 岁）及年龄、性别匹配的健康对照（男性34 例，女性26 例，年龄59.6 ± 12.3 岁）血清标本各60 例，所有患者均经病理学确诊，排除肾囊肿、肾良性肿瘤及其他肾脏疾病。
1.2 仪器与试剂 Trizol 试剂（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；
氯仿、异丙醇、无水乙醇（上海化学试剂公司）；
酸性酚（美国Sigma-Aldrich 公司）；
3 mol/L（pH=5.5）醋酸钠（美国Ambion公司）；
miRNA 检测探针及引物（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；
ExoQuick exosome 提取试剂盒ExoQuick-TC（美国SBI 公司）；
DEPC 水（美国Sigma-Aldrich 公司）；
PCR 试剂包括5 ×AMV buffer，10 mmol/LdNTP，AMV 逆转录酶，10 × PCR buffer,25mmol/L MgCl2，rTaq DNA 聚合酶（均购自大连TAKARA 公司）。5418 型高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；
Tissuelyser-48全自动样品自动研磨仪（上海净信科技公司）；
Nanodrop2000 超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；
2720 型PCR 仪，7300 型实时荧光定量PCR 仪（美国Applied Biosystem 公司）。
1.3 方法
1.3.1 组织RNA 提取：组织标本离体30 min 内迅速冷冻于液氮，后置于-80 ℃保存，避免反复冻融。取黄豆粒大小组织放入1.5 ml 除酶Eppendorf 管中，然后加入1.0 ml Trizol 试剂，运用Tissuelyser-48 充分研磨后加入200 μl 氯仿，并按照Trizol 试剂说明书后续步骤提取组织RNA。RNA 溶于20μl DEPC水后用Nanodrop 2000超微量分光光度计测定浓度，并调节浓度至0.5μg/μl 待用。
1.3.2 血清EV分离：RCC患者及对照血清标本用真空生化管采集空腹静脉血3～5 ml，1 500 g 离心10 min 后取上清置于-80℃冰箱留存待用。血清EVs分离采用ExoQuick exosome 提取试剂盒并按照试剂盒操作说明书，从100 μl 血清中分离EVs后重悬于25μl DEPC 水中待用。
1.3.3 EVs RNA 提取：血清EVs RNA 提取采用课题组前期建立的酸性酚/氯仿一步法进行，提取的RNA 溶于20μl DEPC 水后保存于-80℃冰箱待用[6]。
1.3.4 miRNA水平检测：组织和血清EVs miRNA水平检测采用基于TaqMan 水解探针的RT-qPCR方法进行，miRNA 逆转录PCR，RT-qPCR 反应体系和PCR 参数设置参照课题组前期研究[6]。组织miRNA的水平测定以U6 为内参，表达水平以2-ΔΔCt方法进行计算，其中ΔCt=CtmiR-378-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌组织-ΔCt癌旁正常组织；
血清EV miRNA的水平测定以miR-16 为内参，表达水平以2-ΔCt方法进行计算，其中ΔCt=CtmiR-378-CtmiR-16。
1.3.5 miRNA 靶基因及功能预测：miRNA 靶基因预测采用在线软件TargetScan7.2，miRPathDB 2.0，TarBase 7.0和miRDB 进行，取四种软件预测靶基因交集后进一步采用在线软件Metascape分析miRNA 靶基因参与的生物学功能、调控通路和分子调控网络。
1.4 统计学分析 数据统计、分析和绘图采用Graphpad 8.0 软件。正态分布数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；
非正态分布数据中位数（四分位数间距）[M(P25,P75)]表示，RCC 癌组织和对应的癌旁正常组织miRNA表达水平比较采用wilcoxon 配对秩和检验，RCC患者与健康对照血清EVs miRNA 组间比较采用M-U检验。运用ROC 曲线分析组织和血清EVs miRNA水平对于RCC的辅助诊断价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 RCC 组织中miR-378表达变化 qRT-PCR 测定结果显示，40 例患者组织中，与对应的癌旁正常组织相比，miR-378的表达水平在31 例RCC 组织中呈现降低趋势。miR-378 在RCC 癌组织中相对含量为0.050(0.016，0.137)，在癌旁正常组织为0.134(0.054,0.546)，两组间比较差异有统计学意义（Z=-3.481，P=0.003）。
2.2 RCC患者血清EVs 中miR-378表达变化 qRTPCR 测定结果显示，RCC患者血清EVs 中miR-378相对含量为8.295(4.930,15.60)，健康对照相对含量为3.501(2.005,6.853)，RCC患者EVs miR-378水平高于健康对照组，差异有统计学意义（U=850，P＜0.001）。
2.3 组织和血清EVs miR-378 诊断RCC的ROC曲线分析 见图1。ROC 曲线分析结果显示，组织和血清EVs miR-378 诊断RCC的ROC 曲线下面积分别为0.665（95% CI：0.544～0.786）和0.764（95%CI：0.680～0.848）。组织miR-378的最佳诊断临界值为0.0714，敏感度和特异度分别为62.50%，67.50%；
血清EVs miR-378的最佳诊断临界值为5.137，敏感度和特异度分别为75.00%，65.00%。
图1 RCC 癌组织和血清EV miR-378 诊断RCC的ROC 曲线
2.4 miR-378 靶基因及其调控通路生物信息学分析 见图2。运用在线数据库TargetScan7.2，miRPathDB 2.0，TarBase 7.0和miRDB 预测miR-378 可调控的靶基因数目分别为5 497，8 035，388和653 种，四种数据库预测miR-378 共同靶基因为35 种（图2A）。进一步通过Metascape 数据库对35 种共同预测靶基因进行功能注释和富集通路分析，结果显示miR-378 靶基因主要与基因转录、分解代谢、细胞骨架蛋白调节和蛋白激酶活力调节等RCC 发生、发展密切相关的调控通路相关（图2B）。
图2 miR-378 生物信息学分析
RCC 尚缺乏有价值的血清学分子诊断标志物，而循环miRNA 具备作为RCC 非侵入性血清学分子标志物潜能，其中循环miR-378 在RCC患者外周血中变化报道较多，但不同研究报道结果不一致，miR-378 作为RCC 新型分子标志物价值有待进一步探讨。最新研究表明，血清EVs miRNA 可来源于病变组织或细胞主动分泌，其对于疾病诊断更具价值。本研究针对RCC患者外周血miR-378 变化报道不一致问题，通过对RCC 组织中miR-378的变化和临床价值进行探讨，并对血清EVs miR-378水平进行测定，发现miR-378 在RCC 组织中表达降低，而在血清EVs 中水平显著升高，组织和血清EVs 中miR-378水平测定均可作为RCC 辅助诊断分子标志物，其中血清EVs miR-378的测定更具价值。生物信息学分析结果显示，miR-378 可参与RCC 发生、发展密切相关的通路调控。
循环miR-378 具备成为RCC 诊断标志物的潜能，但不同报道结果不一致。REDOVA 等[3]和FEDORKO 等[4]研究组发现，miR-378 在RCC患者血清中水平显著升高，可作为RCC 诊断分子标志物。HAUSER 等[5]则发现血清miR-378的水平在RCC患者和对照组之间无统计学差异。本课题组前期研究结果发现，miR-378 在早期RCC患者血清中水平显著降低，是RCC 早期辅助诊断潜在的新型分子标志物[6]。报道显示，肿瘤患者特定循环miRNA主要来源于肿瘤组织和细胞，对肿瘤组织miRNA表达测定可为上述不一致结果提供实验依据[8]。本研究针对RCC 组织中测定结果显示，与癌旁正常组织相比，miR-378 在RCC 组织中表达水平明显降低，与早期RCC患者血清中miR-378的变化一致。研究显示，RCC 组织中miR-378的表达与肿瘤分期密切相关，早期（T1 期）RCC 组织中miR-378表达明显低于癌旁正常组织，而中晚期（T2/T3）RCC组织中miR-378表达明显高于癌旁正常组织[9]。结合课题组前期研究及本研究结果，我们推测RCC患者组织和血清中miR-378的表达与患者肿瘤分期密切相关，早期患者降低，中晚期患者升高，这可能是不同研究结果矛盾的潜在原因，也进一步提示组织和血清中降低的miR-378 可作为早期RCC患者辅助诊断分子标志物。
血清EVs miRNA 可来源于病变组织或细胞主动分泌，其水平变化可精准反映病变部位的动态病理变化，对于肿瘤的诊断较组织或循环miRNA 更具价值[10]。本研究针对RCC患者血清EVs miR-378的表达水平测定结果显示，与RCC 组织中miR-378表达降低不同，RCC患者血清EVs miR-378表达水平升高，其对于RCC 诊断价值亦明显优于RCC 组织miR-378 测定。本研究结果显示，RCC患者组织和血清EVs 中miR-378 变化不一致，但具体分子机制不清楚。既往报道显示，结肠癌患者miRNA 变化存在类似的现象。结肠癌患者癌组织中miR-200 家族显著降低，而分泌的EVs 中miR-200 家族则显示升高；
分子机制研究显示，蛋白激酶Cζ（protein kinase Cζ，PKCζ）和ADAR2 调控轴在癌组织和EVs 中miR-200 家族miRNA表达变化中发挥重要作用，癌组织中PKCζ表达缺失导致ADAR2 磷酸化水平降低，后者可促进肿瘤细胞miR-200 家族由胞内以EVs 形式释放至胞外，导致结肠癌组织和细胞中miR-200 家族miRNA表达水平降低，而分泌的EVs 中miRNA水平升高[11]。因此，结合本研究结果，我们推测在RCC 组织和细胞中miR-378 也存在类似的分子调控机制，但是否由PKCζ/ADAR2 调控轴在此过程中发挥作用仍需后续深入研究。
本研究对于miR-378 生物学功能生物信息学分析结果显示，miR-378 靶基因主要与基因转录、分解代谢、细胞骨架蛋白调节和蛋白激酶活力调节等肿瘤调控通路相关。研究显示，miR-378的表达异常与食管鳞癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤密切相关，在肿瘤发生发展中扮演原癌基因或抑癌基因的作用[12-13]。同时，大量研究显示，miR-378 在分解代谢过程中也发挥重要调节作用。KULYTÉ 等[14]证实，miR-378可增强肿瘤恶液质患者脂解作用。SUN等[15]发现，miR-378 可通过调节胆汁酸合成影响胆固醇脂代谢。事实上，分解代谢特别是脂代谢异常又与RCC尤其是肾透明细胞癌的发生发展密切相关[16-17]。因此，推测RCC患者组织中miR-378的异常表达亦可通过对分解代谢的调节参与RCC的发生发展。另外，RCC患者血清EVs 中升高的miR-378 生理病理功能尚不清楚。相关报道显示，血清EVs miR-378水平的升高与血管生成、肿瘤免疫逃逸密切相关，并可作为胃癌的潜在分子标志物[18]。NAN 等[19]发现，脂肪来源干细胞分泌携载miR-378的EVs 可有效促进血管生成。BRIAND 等[20]发现，肿瘤细胞分泌的EVs miR-378 可抑制自然杀伤细胞（NK）颗粒酶B的分泌，降低NK 细胞对于肿瘤细胞杀伤毒性并导致化疗情况下肿瘤细胞免疫逃逸，RCC患者血清EVs 中升高的miR-378 也可通过类似的作用机制发挥癌相关生物学功能参与RCC的发生发展。
本研究对于血清EVs miR-378 作为RCC患者辅助诊断标志物研究结果进一步表明，EVs miRNA是一类较组织miRNA 更具价值和临床转化应用潜能的分子标志物，具有操作方便快捷、能反复获取、易于实时监控等优点[21]。但是，EVs miRNA研究仍面临许多问题。首先，血清EVs分离尚无统一方法。目前应用较多的包括经典的超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、试剂盒法、免疫法等，不同方法各具优劣势[22]。本研究采用的试剂盒应用较为方便，适合单样本血清水平操作，对于EVs miRNA 临床转化应用较具优势，但分离的EVs 纯度可能低于离心法和超滤法。范维肖等[23]通过比较不同EVs分离方法，发现超离法适合EVs 各方面研究，而膜亲和层析法则更适合EVs 核酸研究，这对于后续EVs miRNA研究具有重要的指导作用。其次，EVs miRNA的测定无合适的内参。不同研究对于EVs miRNA的归一化采用的方法各异，这对于EVs miRNA 临床转化应用和推广造成了较大挑战，亦提示EVs miRNA 合适内参及归一化方法仍是未来研究的重要方向。
本研究存在一定的局限性。研究发现RCC 组织中miR-378的表达降低，推测其可能与PKCζ/ADAR2 调控轴作用相关，但具体分子机制仍需后续深入探讨。其次，由于RCC miR-378的表达变化可能与患者临床分期有关，但限于本研究样本纳入有限，且组织样本临床分期主要集中于早期RCC，是否不同分期样本RCC miR-378表达存在统计学差异尚不确定。再次，本研究发现EVs miR-378的表达上调，但样本量相对较少，且来自于同一医院，EVs miR-378的RCC 诊断价值仍需多中心、大样本量研究证实。另外，后续研究中应注重同一患者RCC 组织和血清EVs 中miR-378表达变化研究，对于明确miR-378 临床价值具有较为重要意义。
综上，本研究针对RCC患者血清中变化争议较大的miR-378，对其在RCC 组织和血清EV 中的表达变化进行检测和临床价值分析，发现miR-378 在RCC 组织中降低，在血清EVs 中表达升高，RCC组织和血清EVs 中miR-378水平测定可作为RCC患者辅助诊断分子标志物；
生物信息学分析结果表明miR-378 可通过调控基因转录、分解代谢、细胞骨架蛋白调节和蛋白激酶活力调节等肿瘤密切相关通路参与RCC 发生发展，通过对组织、血清EVs miR-378表达变化分子机制及功能研究可为RCC 诊治提供新的思路和理论依据。
