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韩 勇 李 英 刘玉洁
1.山东省日照市动物疫病预防控制中心，山东日照 276800；
2.山东省日照市五莲县叩管畜牧兽医兽医站，山东五莲 262300
2021年8月2日，山东畜牧兽医局印发《山东省重点动物疫病监测净化工作方案（2021 版），要求推进全省重点动物疫病监测净化，提高规模养殖场管理水平和疫病防控能力，推动动物疫病防控从稳定控制到净化消灭转变。2021年10月7日，农业农村部下发《关于推进动物疫病净化的意见》，要求推进动物疫病净化工作，力争通过5年时间，在全国建立一批高水平的净化场。日照市种禽场较多，既有地方优良品种日照麻鸡，又有国外白羽肉鸡，净化任务艰巨。日照麻鸡是山东省地方优良品种，原产于日照市东北部两城镇一带，山东省胶南市琅琊镇一带也有分布，因此也称“琅琊鸡”。日照麻鸡抗病力强、耐粗饲、肉质风味好、产蛋多，属肉蛋兼用型品种，深受广大消费者的欢迎。1978年，被列为山东地方家禽良种，2009年被山东省畜牧兽医局列入《山东省畜禽遗传资源保护名录》[1]。经过多年的保种和推广，日照麻鸡现存原种1 万余只，祖代鸡5万套，年产父母代鸡苗120 万套，配套品种接近20个。日照麻鸡凭借其独特的表现性状和优异的生产性能，产品销往山东、河南、陕西、山西、江苏、云南、贵州和四川等地，受到市场的广泛认可。20 世纪八九十年代，由于外来品种的引进和杂交改良，日照麻鸡感染禽白血病、鸡白痢、支原体等垂直传播病的病例报道逐渐增多，净化工作刻不容缓。另外，日照市白羽肉鸡种禽场也较多，2020年白羽肉鸡饲养量达到3 000 万只，白羽肉鸡产业发展迅速，但禽白血病等带来的疫病威胁不容忽视。因此，做好白羽肉鸡的疫病净化工作尤为重要。
为从源头上控制疫病，保护和振兴地方鸡种资源，2019年起，日照动物疫病预防控制中心选择日照麻鸡种鸡场3 家，白羽肉鸡父母代场1 家，按照国家和省的要求开展规模鸡场主要疫病净化工作，推动疫病从有效控制向净化消灭转变。本试验通过3年持续监测，了解日照市种鸡场禽白血病、鸡白痢、支原体主要病原感染状况，以期为净化提供技术支撑。
1.1 样品类型和数量
2019年起，选择日照麻鸡种鸡场3 家，包括原种、祖代和父母代各1 家，选择白羽肉鸡父母代场1家，每年开展2 次监测。原种场按照置信水平95%，预期流行率3%，每次采样不少于100 份。祖代场按照置信水平95%，预期流行率6%，每次采样不少于50 份。父母代场按照置信水平95%，预期流行率10%，每次采样不少于30 份。样品来源每个种鸡场不少于4 栋鸡舍的鸡只，种公鸡、开产母鸡和后备鸡要兼顾一定比例。每只鸡采集血清、鼻腔拭子、蛋清，编号一一对应。
1.2 样品采样和处理方法
1）血清。用促凝血管采集全血2 mL，室温静置30 min 以上，待析出血清后，3 000 r/min 离心3～5 min，将血清0.5 mL 取出放置1.5 mL 离心管内，做好编号。
2）棉拭子。将1～1.2 mL PBS 缓冲液滴入1.5 mL离心管，将棉签插入口腔、鼻腔内部，来回旋转3～4次，将沾取黏液的棉棒放入离心管内，棉签头折断将离心管盖上，离心管中静置过夜，浸出液上清进行试验，采集口腔和鼻腔双拭子，将拭子放置一个离心管内，每只鸡采集的棉拭子和血清一一对应。
3）蛋清。将鸡蛋固定放好，用酒精擦拭后在一侧打孔，用无菌移液枪头或针管吸取适量蛋清，注意不要碰到蛋黄。每枚鸡蛋吸取2 管蛋清，每管吸取0.5 mL 于1.5 mL 离心管内，放置于-80 ℃冰箱内备用，试验前需反复冻融3 次。每只鸡采集的棉拭子和血清、蛋清一一对应。
1.3 检测方法和试剂
支原体荧光RT-PCR 检测试剂盒购自北京世纪元亨公司。鸡白痢抗原购自青岛立见公司，禽白血病p27 抗原、J 抗体、A/B 抗体均购自爱德士公司，鸡毒、滑液囊支原体抗体ELISA 试剂盒均购自荷兰百测公司。
1.4 主要仪器设备
核酸提取仪是西安天隆公司、实时荧光PCR 仪是美国ABI 公司、酶标仪购自美国MD 公司、离心机购自Sigma 公司等。
1.5 方 法
采集的鼻腔和口腔双拭子提取病毒核酸，采用荧光定量PCR 方法，检测支原体病原。采集血清进行禽白血病p27 抗原、J 抗体、A/B 抗体ELISA 检测，采集的血清进行支原体ELISA 试验，鸡白痢抗体检测采用平板凝集试验。试验操作严格按照试剂盒说明书进行。
2.1 不同年份感染情况
2019-2021年连续3年监测，禽白血病、鸡白痢、支原体场阳性率总体呈下降趋势，表明净化取得显著成效。日照市种鸡场禽白血病感染类型主要是J 型，其次是A/B 型。4 个种鸡场均检测到禽白血病、鸡白痢、支原体，禽白血病、鸡白痢净化效果高于支原体。虽经过监测净化，但滑液囊支原体和鸡毒支原体场阳性率均较高（表1）。
表1 2019-2021年场病原学阳性率统计%
2.2 种鸡场感染情况
2019-2021年连续监测显示，4 个种鸡场禽白血病、鸡白痢、支原体个体阳性率总体呈下降趋势，净化效果明显。原种场禽白血病、鸡白痢、支原体的个体阳性率低于祖代场，祖代场禽白血病、鸡白痢、支原体的个体阳性率低于父母代场。日照麻鸡原种场经过3年净化监测，2021年未检测到禽白血病、鸡白痢和支原体病原，净化取得显著成效。但检测的1 个祖代和2 个父母代场禽白血病、鸡白痢和支原体感染依然严重，尤其支原体污染面较广，个别种鸡场个体阳性率达到10%，应引起重视（表2）。
表2 日照市种鸡场主要疫病个体阳性率%
3.1 净化总体情况
日照市自2019年以来，在全市选择4 家种禽场开展主要禽病净化工作。经过3年的连续净化监测，禽白血病、鸡白痢、支原体场和个体总体阳性率均呈下降趋势，净化取得了一定成效。其中，日照麻鸡原种场净化效果尤其明显，2021年未检测到禽白血病、鸡白痢和支原体病原。
陈静等[2]对山东五大优质地方名鸡检测发现，目前困扰山东地方鸡的ALV 主要为ALV-J；
芦花鸡与琅琊鸡群中存在ALV-A、ALV-J 的共感染。本试验监测结果也显示，日照麻鸡感染的禽白血病主要以J-ALV 为主，其次是A/B-ALV。禽白血病、鸡白痢和支原体是垂直传播疫病，能通过垂直传播至下一代，引起鸡只生产性能下降、生长缓慢等症状，造成更大范围的感染，给养禽业造成巨大经济损失。本试验通过3年的净化监测，2021年4 个种鸡场有3 个未检测到禽白血病和鸡白痢，但支原体的感染仍较严重，给种鸡场带来较大的经济损失，应引起足够重视。
3.2 地方品种日照麻鸡感染较严重
日照麻鸡作为山东优良地方品种，经过多年的保种和推广，日照麻鸡现存原种1 万余只，祖代鸡5万套，配套品种接近20 个。20 世纪八九十年代，由于外来品种的引进和杂交改良，地方品种鸡感染禽白血病、鸡白痢、支原体的病例报道逐渐增多，杨凤等[3]在山东采集255 份芦花、日照麻鸡等地方品种，P27 抗原阳性率为50.98%，采集41 份病料用PCR检测，33 份呈ALV-J 阳性（80.49%）。羊扬等[4]选择腿病发病较少的3 个黄羽肉鸡养殖公司的肉鸡场采样，于2018年6月进行采样，滑液囊支原体（MS）抗体阳性率均高于80%。本试验检测结果也显示，日照麻鸡种鸡场禽白血病、鸡白痢、支原体感染较严重，尤其支原体感染率较高，个别场个体阳性率达到10%，对保种构成较大威胁，需加大净化力度。
3.3 白羽肉鸡感染情况
据韩雪等[5]报道，部分饲养进口品种的鸡场也有禽白血病抗原或抗体检出，进口品种的引种控制和阴性鸡群的净化维持仍需要加强。白羽肉鸡在日照市饲养量较大，课题组选取1 家白羽肉鸡种鸡场开展净化，成效显著。2019-2021年连续3年监测净化显示，禽白血病、鸡白痢、支原体的阳性率总体呈下降趋势，但支原体的感染仍严重，需继续加强管理和防控，做好净化工作。
3.4 下一步工作重点
经过3年持续监测净化，4 个种鸡场禽白血病、鸡白痢、支原体阳性率总体呈下降趋势，尤其禽白血病和鸡白痢净化成效显著，仍需加大净化力度。4个种鸡场支原体的感染较严重，个别种鸡场个体阳性率达到10%。支原体往往因治疗不力而继发大肠杆菌感染，导致患病鸡体自身黏膜屏障保护力降低，造成免疫失败，继而诱发禽流感和新城疫等疫病，给养禽业造成很大经济损失。支原体除可水平传播外，还可垂直传播[6-7]，危害严重，应作为日照市下一步规模种鸡场净化的重点疫病。
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