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丁 媛，郑博予，祁宏伟
吉林省农业科学院动物营养与饲料研究所，吉林公主岭 136100
乳酸菌能够促进动物体对营养物质的消化吸收，还能通过抑制有害菌株的生长繁殖，从而维持机体内微生物菌群的平衡，诱发机体产生免疫应答反应来增强机体自身的免疫能力。本文通过对其生理生化、耐酸、耐胆盐等方面进行鉴定从而筛选出优势牛源乳酸菌作为出发菌，为下一步发酵工艺条件研究、优化以及微生态制剂制备提供了优良的出发菌种。
粪便样品采集于吉林省公主岭市张家街牛场健康成年牛的新鲜粪便；
抑菌试验所用菌株：致病菌菌株均由本实验室保存；
40只昆明小鼠（20±2 g）购自南京青龙山动物饲养场。
2.1 样品采集和处理
将牛新鲜粪便样本稀释涂布于MRS培养基中，37 ℃厌氧培养24 h。对单菌落进行平板划线法纯化后，放置-80 ℃冰箱备用。
2.2 疑似乳酸菌的形态及生理、生化特征鉴定
显微镜镜检观察菌体的形态，对疑似乳酸菌进行鉴定。
2.3 疑似乳酸菌生长特性鉴定
2.3.1 菌液活化后经梯度稀释后接种于MRS液体培养基中，置于不同温度下培养7 d，测定OD600值。
2.3.2 使用HCl溶液和NaOH溶液将配好的MRS液体培养基调至不同pH值，接种疑似单菌落，培养7 d后，测定OD600值。
2.3.3 向MRS液体培养基中添加不同浓度的NaCl后接种菌，培养7 d，测定OD600值。
2.4 16 S rRNA 基因序列的测定与细菌鉴定
将纯化后的菌液离心后送去测序。
2.5 生长曲线及产酸曲线
取1 mL活化后的菌液加入装有100 mLMRS液体培养基的培养瓶中，分别于1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、24 h时测定菌液OD600的吸光值和pH值，并倍比稀释涂板计数。以MRS液体培养基为阴性对照。
2.6 耐受性
通过调整培养基pH、添加0.5%胆盐以及使用特定菌测定其耐受性[1]。
3.1 筛选
从健康肉牛的新鲜粪便中共筛选出20株疑似乳酸菌菌株，20株疑似乳酸菌菌株中杆菌共有15株、球菌共有5株，命名为Z1～Z20。
3.2 形态、生理生化特征鉴定
通过对疑似乳酸菌菌株形态以及生理生化特征上的鉴定分析最终筛选出5株菌株，分别为Z6、Z8、Z11、Z15、Z18。这5株菌株均为杆状，且革兰氏染色均为阳性。发酵葡萄糖产酸不产气，并且发酵方式为同型发酵。
3.3 生长特性鉴定
对这5株植物乳杆菌在不同pH、温度及盐度条件下的生长特性进行测定发现，均能够在45 ℃的条件下良好生长；
4 ℃和6.5% NaCl条件下Z11、Z6和Z18均能够生长，而其他的菌株呈现微弱生长和不生长；
在pH3.0条件下，菌株Z18不生长，菌株Z11和Z15生长，菌株Z6和Z8呈现微弱生长。结合测定结果综合分析选择Z11进行后续试验。
3.4 16S rRNA 基因序列测定
通过16S rRNA基因测序进行分析，并使用Mega 7.0对乳酸菌Z11进行系统进化树的构建结果表明，乳酸菌Z11与植物乳杆菌NRRL B-14768相似度可达100%。
3.5 生长曲线测定以及产酸曲线测定
植物乳杆菌Z11在接种后数据表明，4 h时，Z11开始成对数生长，通过10 h的生长繁殖，在14 h时进入稳定期。4 h内pH趋于稳定，4 h后开始降低，培养至28 h时，pH降至3.96。
3.6 耐受性试验
在pH3.0条件下，3 h后存活率93.79%。在0.5%胆盐条件下，0 h菌落数6.45 lg（CFU/mL），3 h菌落数为5.54 lg（CFU/mL），存活率为86.31%。在pH3.0与0.5%胆盐条件下，虽然植物乳杆菌Z11 3 h时菌落数与0 h相比均为下降趋势，但0 h与3 h之间的菌落数均差异不显著（p＞0.05）。表明Z11对酸性以及胆盐环境均有一定的耐受性。
3.7 抑菌性试验
由表1可知，植物乳杆菌Z11对致病菌均有抑制作用。
表1 Z11对病原菌的抑菌性能
3.8 药物敏感性试验
由表2可知：β1内酰胺类、四环素类、酰胺醇类、大环内酯类以及磺胺类抗生素均可抑制Z11生长。
表2 Z11药物敏感性能
众所周知，自然环境中的个体与微生物之间存在着一定的密切关系才得以维持世间平衡[2]。在微生物的生长过程中，分为适应期、对数期、稳定期和衰亡期4个时间段[3]。了解菌株这4个时间段发生的时间能够掌握对应时间内该菌株的生长状况。李雪莉等[4]试验结果发现有乳酸菌菌株在接种后4 h进入对数生长期，12 h后达到生长稳定期。本试验根据对植物乳杆菌Z11生长曲线的研究发现，在4 h时植物乳杆菌Z11进入了对数生长期，经过10 h的生长繁殖，在14 h后进入了生长稳定期，细菌数较高，稳定性较好，可适用于在生产中使用。
发酵液pH能够直观地反映菌株的产酸能力，培养4 h后，植物乳杆菌Z11的pH开始下降，24 h时pH降至3.96，16 h后pH值趋于稳定，适合应用于微生物菌剂的制备。
Z11在pH为3.0时存活率可达93.79%，0.5%胆盐条件下存活率可达86.31%，说明植物乳杆菌Z11对于低酸的胃环境以及胆盐的肠道环境均有较好的抵御力。
Z11对常用的抗生素β1内酰胺类、四环素类、硝基呋喃类等常用抗生素敏感。有报道指出乳酸菌具有代替抗生素的潜在作用，原因为在其生长繁殖的过程中能够产生大量有机酸以及抑菌物质。有机酸可以通过降低肠道pH值来改善肠道内的内环境，促进优势菌株的生长繁殖，维持肠道内的平衡状态，抑菌物质与酸性环境结合可以抑制多种病原性细菌的生长繁殖。本试验中，Z11对常见病原菌的生长起到抑制作用，这可能与其产酸能力有关，但乳酸菌生长过程中产生的物质较多，是否产生抑菌物质从而导致抑制病原菌生长还需深入探究。
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