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李娇珍，孙正海，蔡起航，丁慕溪，房佳茹，王坤
(1.西南林业大学 园林园艺学院,云南 昆明 650224;2.云南省面向南亚东南亚经济林全产业链联合研发中心,云南 昆明 650224;3.云南省高效经济林培育示范型国际科技合作基地,云南 昆明 650224)
积雪草(Centellaasiatic(L.)Urban)为伞形科积雪草属多年生草本植物，别名雷公根、马蹄草、钱齿草、打的落、十八缺、半边钱、崩大碗等，其广泛分布于南北半球热带和亚热带地区，在我国主要分布在长江以南的华南、华东、中南及西南地区[1]。在古代积雪草就已经被收载为常用中药，最早出现于《神农本草经》，其味苦、辛，寒，归肝、脾、肾经，具有清热利湿、解毒消肿的作用，用于湿热黄疸、中暑腹泻、石淋血淋、痈肿疮毒、跌打损伤等[1-2]。在现代临床医学中研究发现，积雪草还有抗抑郁、抗肿瘤、保护神经系统以及免疫调节作用[3]。积雪草应用形式多样，除作药用外也广泛被食用，有国外学者利用积雪草的植物提取物开发功能性饮料[4]，在我国以干燥叶片入茶，多用于凉茶，在东南亚一些国家新鲜叶可作蔬菜或果汁[5]；
此外，基于其抑制瘢痕增生及修复皮肤损伤的作用，已经被大量用于美容，因此逐渐成为重要的商业产品。
积雪草作为药食同源植物一直广受关注，目前国内外的研究者们对积雪草的主要化学成分及提取方法、药理作用及其作用机制进行广泛而深入的研究。对积雪草化学成分研究发现其化学成分主要包括三萜类、多炔烯烃类、黄酮类和挥发油类等[6-7]。近几年来相关学者关于积雪草的化学物质有新的发现，徐晓卫等[8]通过气相色谱-质谱法研究积雪草全草挥发油的化学成分共鉴定出 57种化合物；
张伟等[9]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(HS-SPME-GC-MS)，从积雪草中鉴定出16种挥发性成分；
马灿等[10]以积雪草酸结构为母核，经乙酰化、水解等反应合成一个新的未见报道的积雪草酸所对应的苷酯；
Bo Ren等[11]在2021年从积雪草全草中分离得到2种未被描述的乌拉烷型三萜皂苷，分别命名为积雪草苷H 和积雪草苷I；
2022年有学者在探索积雪草全草的生物活性化合物时，发现两种新的黄酮醇衍生物[12]。在化学物质含量方面的研究中张小刚[13]测定了14种不同居群积雪草主要成分积雪草苷的含量，发现不同来源积雪草之间化学成分有较大的的差异；
王青等[6]在2014年测定了不同产地积雪草中积雪草苷和羟基积雪草苷，发现不同产地含量差别较大；
闫凯等[14]在2017年建立超高效液相色谱串联三重四级杆质谱( UPLC-MS/MS)同时测定积雪草中 7 种有效成分的含量；
张培培等[15]比较研究中国和印尼积雪草药材化学成分的差异，发现来源于中国的积雪草药材中积雪草苷含量较高，而印尼积雪草药材中积雪草苷含量较低；
2020年有国外学者对积雪草叶粉化学及元素成分进行评价[16]，目前未见对积雪草不同部位中的化学物质进行报道。本研究以积雪草的根、茎和叶3个不同组织部位作为研究对象，利用非靶向代谢组学液相色谱-质谱法(LC-MS)对积雪草不同部位中的化学成分进行检测，以期为后续其药理学研究及应用提供科学依据。
1.1 材料
1.1.1 仪器与试剂
Vanquish液相色谱仪 (Thermo赛默飞世尔科技公司)，Q Exactive型质谱仪(Thermo赛默飞世尔科技公司)，高速冷冻离心机(H1850-R，湖南湘仪实验设备有限公司)，混匀仪( BE-96，海门麒麟贝尔实验室仪器有限公司)，超声波清洗机(KW- 100TDV，昆山舒美实验设备有限公司)，组织研磨机(MB-96，浙江美碧实验设备有限公司)，滤膜(0.22 μm PTFE，天津金腾实验设备有限公司)，玻璃珠(G8772-500G，Sigma)。
甲醇(LC-MS级)、乙腈(LC-MS级)购自赛默飞世尔科技公司，2-氯-L-苯丙氨酸购自上海阿拉丁生化科技公司，甲酸购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司、甲酸铵购自默克公司、H2O使用Milli-Q系统产生超纯水(密理博)。
1.1.2 试验材料
试验材料积雪草于2021年11月采于云南省楚雄州元谋县(海拔1 035.1 m，102.41°E、25.54°N)的自然野生种，经过专家鉴定为积雪草。取积雪草的根、茎和叶各3个生物学重复用于后续试验。
1.2 方法
样品提取 精确称量适量样本于2 mL离心管中，加入600 μL甲醇〔含2-氯-L-苯丙氨酸(4 μmol/L)(-20 ℃保存)〕，涡旋振荡30 s；
加入100 mg玻璃珠，放入组织研磨器中，60 Hz研磨90 s；
室温超声15 min；
12 000 rpm 4 ℃离心10 min，取上清液过0.22 μm膜过滤，过滤液加入到检测瓶中，用于LC-MS检测。
色谱条件 ThermoVanquish(ThermoFisherScientific,USA)超高效液相系统，使用ACQUITYUPLCHSST3(2.1×150 mm,1.8 μm)(Waters,Milford,MA,USA)色谱柱，0.25 mL/min的流速，40 ℃的柱温，进样量2 μL。正离子模式，流动相为0.1%甲酸乙腈(C)和0.1%甲酸水(D)，梯度洗脱程序为：0～1 min，2%C；
1～9 min，2%～50%C；
9～12 min，50%～98%C；
12～13.5 min，98%C；
13.5～14 min，98%～2%C；
14～20 min，2%C。负离子模式，流动相为乙腈(A)和5 mM甲酸铵水(B)，梯度洗脱程序为：0～1 min，2%A；
1～9 min，2%～50%A；
9～12 min，50%～98%A；
12～13.5 min，98%A；
13.5～14 min，98%～2%A；
14～17 min，2%A。
质谱条件 ThermoQExactive质谱检测器(ThermoFisherScientific,USA)，电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为-2.50 kV，鞘气30 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率70 000进行一级全扫描，一级离子扫描范围81～1 000 m/z，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30%，二级分辨率为17 500，采集信号前10离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息[17]。
2.1 积雪草代谢产物分析
选取积雪草叶片、茎和根3组，设3个生物学重复共9个样品，进行代谢组分析，基于LC-MS非靶向检测共检测出440种代谢物质。其中氨基酸及其衍生物、生物碱、类脂化合物、糖与苷类以及萜类等5类代谢产物在积雪草代谢物质中所占比例最高，均达到10%以上，分别有60种、54种、52种、50种和49种，还检测到有机酸21种，甾族化合物15种，黄酮类12种，此外还有极少数的简单苯丙素类、维生素及木质素、香豆素和挥发油类物质，不同类型代谢物质相对所占比例见图1。
图1 积雪草中不同类型的代谢产物及其相对占比
对相同种类代谢产物在积雪草不同部位中的相对含量分析发现，萜类和黄酮类物质在叶片中含量明显高于茎部和根部；
氨基酸及其衍生物、生物碱类、类脂化合物、糖与苷类、酚类及酚酸类以及有机酸类物质的相对含量都是根部高于茎部和叶部；
挥发油类物质在茎和根中的相对含量显著高于叶部；
其余代谢物质(核苷酸及其衍生物、甾族化合物、简单苯丙素类、维生素及木质素、香豆素及挥发油)在叶片、茎部和根部的含量都差别不大(表1)。
表1 积雪草叶片、茎和根中代谢产物具体成分、数量及含量的平均值
2.2 有效成分分析
根据检测结果，代谢产物中积雪草有效成分被检测出的有α-香树脂醇型三萜皂苷类积雪草苷和α-香树脂醇型三萜酸类积雪草酸2种物质。对积雪草叶片、茎和根中的相对含量分析表明，积雪草苷和积雪草酸均在其叶片中含量最高，根中含量最低；
其中积雪草苷在叶片中的含量显著高于茎部和根部，而积雪草酸在叶片和茎中显著高于其根部；
此外由表2可知在积雪草的不同部位中积雪草酸的相对含量均明显高于积雪草苷。
表2 积雪草中积雪草苷和积雪草酸不同部位相对含量
2.3 黄酮类成分分析
在此次LC-MS非靶向检测中，从积雪草根、茎和叶中共检测出12种黄酮类物质(表3)，其中有6种属于黄酮，3种属于黄酮醇，还有异黄酮、二氢黄酮以及二氢查尔酮各1种。进一步对12种黄酮类代谢产物分析发现，山奈酚、牡荆素和木犀草素在积雪草叶片中的相对含量极显著高于根部和茎部，其中以山奈酚的相对含量最高，牡荆素次之；
橙皮素、黄芩素、根皮苷、黄芪苷在积雪草三个部位的总体相对含量较低，其中以黄芩素和根皮苷最低；
桔皮素在其茎中相对含量较高，而根和叶中相对含量接近，但总体含量也相对较低；
漆树黄酮、川陈皮素、槲皮素、染料木素在积雪草根、茎和叶中的相对含量接近(图2)。
表3 积雪草中黄酮类成分不同部位相对含量
图2 积雪草中黄酮类物质在不同部位的相对含量
积雪草在我国多个地区广泛分布，其在中草药应用方面全株入药，因此在采药时会将整株植株挖掉，这是对植物资源和生态环境的极大破坏。本研究采集云南省野生积雪草植株的叶片、茎和根，利用LC-MS对其进行非靶向代谢组检测，分析其不同部位代谢物质的种类及其相对含量，并对积雪草中2种重要的有效成分(积雪草苷及积雪草酸)和黄酮类成分在根、茎和叶中的相对含量进行分析。
积雪草苷和积雪草酸是积雪草中其非常重要的两种主要成分，它们的主要功效也非常相似，其中积雪草苷能够有效抑制肿瘤细胞扩散，在治疗恶性肿瘤方面具有积极治疗作用，同时也因为其对于创面愈合有一定作用，可预防缓解人类的皮肤创伤和溃疡，更能减少皮肤结核和麻风病发生[18]；
积雪草酸对皮肤溃疡、疤痕疙瘩、局限性硬皮病、萎缩性硬化性苔藓等一些皮肤病具有较好的治疗效果[19]，此外还具有降血脂及保护肝脏的作用[20]。在本研究中积雪草的两种主要有效成分在3个不同部位中，积雪草酸的相对含量都显著高于积雪草苷，且两种物质都是在其叶片中最高，茎部次之，根部最低。综上所述，在后续对积雪草的应用中，若仅需要积雪草苷或积雪草酸时只需采摘其叶片而将根部保留让其继续生长，这样既可以保证积雪草的药用价值也可以保护植物资源和生态环境。
积雪草所含化学成分多样，其中黄酮类化合物作为植物次级代谢产物之一，不仅在植物生长发育过程中具有重要作用，而且具有显著的药理活性，如二氢黄酮类化合物柚皮素(naringenin)具有抗炎、抗癌活性[5]；
黄酮醇类化合物山奈酚(kaempferol)具有抗焦虑、抗过敏活性[21]；
异黄酮类化合物染料木素(genistein)对前列腺癌、乳腺癌等癌症的发生发展具有抑制作用等[22]。在前人的研究中发现积雪草中含有多种黄酮类物质，但是未见有研究者对其不同部位中的黄酮类化合物进行研究，本研究通过LC-MS在积雪草中检测出5类共12种黄酮类化合物，这些黄酮类物质的总含量及其在积雪草不同部位中的相对含量均有所差异，相较于已经报道关于积雪草化学物质的相关文献，本研究弄清黄酮类物质在积雪草不同部位的相对含量，丰富了积雪草中黄酮类化合物的研究，为后续研究积雪草中黄酮类化合物的药用价值和产品开发提供参考。
本试验研究结果表明：在积雪草中各类代谢物质的数量有所差异，并且在不同部位中各类化学成分的相对含量也具有一定差异。该结果与李文芳等[23]对独根草不同部位几种化学成分的分析及张少平等[24]在对马齿苋根茎叶中类黄酮代谢的研究结果相似，证明此研究结果具有一定的科学性。在不同部位代谢物质含量有所差异可能与植物各器官自身的代谢活动以及相关次生代谢产物的转运、储藏存在差异有关，也可能是因为各部位的初生代谢产物含量差异较大，导致各类次生代谢产物的相对含量不同。
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