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邵伟伟，邹琳*，柴琳琳，程晓丹，王树人
(南京大学医学院附属盐城第一医院病理科，盐城 224001)
随着生活水平的提高、防癌意识的增强，近年来越来越多的乳腺癌被发现且发病有年轻化趋势。尽管临床上有多种辅助检查手段(B 超、钼靶、磁共振成像等)可以被用来尽早地发现潜在患者，但不幸的是相较于原位癌来说绝大多数被发现的病例依然是浸润性癌。2019 年国家癌症中心数据显示乳腺癌已居我国女性肿瘤发病率的首位，严重危害女性身心健康。乳腺癌在发生、发展过程中涉及多条分子路径，本研究通过检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)蛋白及基因在乳腺癌中的表达情况，探讨它们在乳腺癌发生及进展中的作用及意义。
1.1 一般资料 收集2017 年1 月—2020 年9 月南京大学医学院附属盐城第一医院手术切除的乳腺癌标本215 例，其中浸润性导管癌(infiltrating ductal carcinoma,IDC)184 例，各级别导管原位癌(ductal carcinoma in situ,DCIS) 31 例。患者年龄25～83 岁，中位年龄52 岁。全部病例术前均未行放、化疗及靶向治疗，取10 例癌周正常乳腺组织作为对照组，所有组织均采用中性甲醛固定后常规石蜡包埋、切片、HE 染色。2 位高年资医师重新阅片以进一步明确组织学分级及临床分期。本实验经南京大学医学院附属盐城第一医院伦理委员会批准，伦审号[2021]-(K-001)。
1.2 方法
1.2.1 EGFR 及HER-2 免疫组化检测 EGFR 及HER-2 兔抗人单克隆抗体及SP 试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，均为即用型。石蜡组织常规脱蜡、水化，经组织抗原修复和10%正常血清封闭后，按说明书操作步骤进行，显微镜下二氨基联苯胺显色、复染、脱水、透明、封片。用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)代替一抗处理的切片作为阴性对照片，已知阳性片作为阳性对照片。
1.2.2 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测HER-2 基因扩增 HER-2 探针购自北京金菩嘉医疗科技有限公司，探针通过与细胞核内的DNA 靶序列杂交，在荧光显微镜下观察并分析细胞核内杂交于DNA 靶序列的探针信号，以获得细胞核内染色体(或染色体片段)上基因状态的信息，操作步骤按说明书进行。
1.2.3 结果判断 EGFR 阳性染色定位于细胞膜和(或)细胞质中，呈棕黄或棕褐色，每张切片随机计数500 个以上肿瘤细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比。≥50%为+++，＜50%～＞25%为++，25%～＞5%为+，≤5%为-。HER-2 阳性染色定位于细胞膜上，呈棕黄色或棕褐色颗粒，根据2019 版指南[1]，判读：无染色或≤10%的癌细胞呈现不完整的、微弱着色为-，＞10%且细胞膜不完整、微弱着色为+，＞10%且细胞膜弱-中等强度完整着色或≤10%但强而完整的着色为++，≤10%且细胞膜强而连续完整着色为+++。HER-2 基因扩增判断标准[1]：(1)HER-2/CEP17比值≥2.0 且平均HER-2 拷贝数/细胞≥4.0 或HER-2信号连接成簇时为HER-2 扩增阳性。(2)HER-2/CEP17 比值≥2.0 且平均HER-2 拷贝数/细胞＜4.0：增加计数细胞，若结果维持不变，则判为HER-2 扩增阴性。(3)HER-2/CEP17 比值＜2.0 且平均HER-2拷贝数/细胞≥6.0：增加计数细胞，若结果维持不变，则判为HER-2 扩增阳性。(4)HER-2/CEP17 比值＜2.0 且平均HER-2 拷贝数/细胞≥4.0 且＜6.0，重新计数，结果不变则结合免疫组化并备注。
1.2.4 统计学方法 采用SPSS 11.5 英文版统计分析软件对相关数据进行处理。率的比较采用χ2检验和Fisher-exact 检验，采用Spearman 等级相关分析两指标间的关系，检验水准均采用α=0.05。
2.1 EGFR、HER-2 在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达 EGFR 阳性染色定位于细胞膜和(或)细胞质中，HER-2 阳性染色定位于细胞膜上(图1，见封三)，在乳腺癌组织中两者阳性表达率分别为22.79%、60.47%，在正常组织中两者阳性表达率分别为10%、0，HER-2 在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达差异有统计学意义(χ2=14.320 7,P＜0.001)，EGFR 在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达差异无统计学意义(χ2=0.904 5,P=0.342)，见表1。
表1 EGFR、HER-2 在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达
图1 EGFR、HER-2 在正常乳腺及乳腺癌组织中的表达(SP,100×)
2.2 DCIS 组织中EGFR、HER-2 的表达与临床病理因素间的关系 DCIS 组31 例组织中EGFR、HER-2的表达与患者年龄及组织学分级均无关(均P＞0.05)，EGFR 的表达与肿瘤大小相关(P＜0.05)，而HER-2的表达与肿瘤大小无关(P＞0.05)，EGFR 的表达与肿瘤发生部位无关(P＞0.05)，但HER-2 的表达与肿瘤发生部位相关，左侧明显高于右侧(P＜0.05)，见表2。
表2 DCIS 组中EGFR、HER-2 的表达与临床病理因素的关系
2.3 IDC 组织中EGFR、HER-2 的表达及与临床病理因素间的关系 IDC 组184 例组织中EGFR、HER-2 的表达与肿瘤大小、组织学分级、TNM 分期及有无淋巴结转移相关(均P＜0.05)，而与肿瘤发生部位及患者年龄无关(均P＞0.05)，见表3。
表3 IDC 组中EGFR、HER-2 的表达与临床病理因素的关系
2.4 IDC 组EGFR、HER-2 蛋白表达的相关性 184例IDC 组织中EGFR、HER-2 蛋白共阴性表达60例，共强阳性表达3 例，两者的表达无相关性(r=0.013,P=0.858)，见表4。
表4 IDC 组EGFR、HER-2 蛋白表达的相关性
2.5 IDC 组EGFR 蛋白表达与HER-2 基因扩增的关系 EGFR 蛋白阴性表达142 例中HER-2 基因扩增阳性26 例(图2)，EGFR 蛋白阳性表达42 例中HER-2 基因扩增阳性15 例，差异有统计学意义(χ2=5.670,P=0.017)，进一步做Spearman 等级相关分析，结果发现两者呈正相关(r=0.176,P=0.017)，见表5。
图2 FISH 检测HER-2 基因呈簇状扩增(SP,1 000×)
表5 IDC 组中EGFR 蛋白表达与HER-2 基因扩增的关系
酪氨酸蛋白激酶受体在细胞的生长及分化中起重要作用，其家族有50 多种成员[2]，其中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族，亦称erbB 家族，由4 个成员组成，它们具有相似的结构和序列，包含一个胞外配体结构域，一个跨膜结构域和胞内酪氨酸激酶结构域，除erbB2(HER-2)之外，erbB 的激活首先需与细胞外配体结合，然后与相邻的受体酪氨酸蛋白激酶交联和反式自磷酸化，随后通过复杂底物蛋白磷酸化启动下游信号通路，这些信号通路调节细胞存活、凋亡、增殖、分化、运动和血管生成，还上调、激活上皮间质转化(癌细胞迁移和侵袭的关键过程)基因的表达，从而导致转移的发生[2-3]。现已发现erbB 家族参与多种实体肿瘤的发生及进展，尤其是在乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌中[4-6]。
本研究结果发现EGFR 在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达阳性率分别为22.79%、10.00%，与文献[7]的报道不一致，究其原因：(1)本研究纳入正常乳腺组织样本量较少；
(2)乳腺癌组为Ⅰ～Ⅲ期病例，未纳入Ⅳ期病例；
(3)采用免疫组化方法检测EGFR 的敏感性及特异性较差，存在假阴性可能。HER-2 蛋白在乳腺癌组及正常乳腺组织组中的阳性表达率分别为60.47%、0，差异有统计学意义。IDC 组中随肿瘤的进展(体积的增大、出现淋巴结转移、高TNM 分期及高组织学分级)，EGFR、HER-2 的阳性表达率呈上升趋势，与文献[8-10]的报道一致。原因：(1)EGFR 位于细胞膜表面，与配体如转化生长因子、表皮生长因子结合后由单体转化为二聚体，激活其位于细胞内的激活位点以完成自磷酸化，接着诱导下游信号传导通路(如PI3K/AKT、Ras/MEK/ERK 等)，诱导细胞增殖、迁移[2]；
(2)现已在多种实体肿瘤中发现突变型EGFR的存在[11-12]，当EGFR 基因出现缺失、突变和重排或因结构域缺失而导致受体下调机制破坏时会导致EGFR 出现持续活化，进一步加速肿瘤细胞的生长，导致患者出现高TNM 分期和高组织学分级。在DCIS 组中除了发现HER-2 的表达与肿瘤发生部位相关外，未发现两者与其他临床病理因素间存在关系。由于DCIS 在临床TNM 分期中属于Tis，患者预后较好。
在IDC 组中，EGFR 蛋白与HER-2 蛋白的表达没有相关性，可能是由于EGFR 的活化需与配体结合，但HER-2 可不直接与任何已知的配体结合，其介导的信号通路的激活是通过配体激活的EGFR 或ERBB3 异源二聚作用发生，或当其高浓度存在时，通过均质二聚作用发生，从而启动类似于EGFR 的下游信号级联。因此乳腺癌进展过程中HER-2 蛋白的过表达可独立于EGFR 发生，两者可无相关性。本研究还发现EGFR 蛋白与HER-2 基因扩增呈正相关，提示HER-2 基因扩增的过程中，活化的EGFR可能发挥了协同作用。
目前针对乳腺癌是采取手术、内分泌、化疗及靶向治疗的综合治疗方案，根据不同的分子分型结果采用精准治疗。其中应用最为广泛的靶向药物(赫赛汀)是针对HER-2 基因扩增为阳性或免疫组化为强阳性表达的病例，取得了较好的临床治疗效果。其作用机制：(1)赫赛汀竞争性地与HER-2 受体结合，抑制细胞内外信号传递，降低细胞增殖、迁移能力；
(2)可加速HER-2 受体降解，使HER-2 受体表达下调，抑制癌细胞的生长；
(3)抑制血管内皮生长因子的生成，阻断肿瘤内的新生血管。EGFR 的靶向治疗目前主要是应用于非小细胞肺癌中，其作用机制[13]为：(1)封闭配体分子如ABX-EGF 对EGFR 的激活；
(2)通过竞争性结合EGFR 的TK 区从而抑制EGFR 激酶活性；
(3)利用RNAi 作用机制对EGFR 进行降解；
(4)对富含EGFR 肿瘤细胞选择性杀死；
(5)通过阻碍EGFR的二聚化/寡聚化从而抑制EGFR 的激活。虽然目前抗EGFR 在乳腺癌的靶向治疗中意义不明确，但是EGFR 与HER-2 有50%的同源性，且其在非小细胞肺癌的治疗中已被证实可显著改善患者预后，因此研究其在乳腺癌中的表达是有必要的。
本研究结果表明，EGFR、HER-2 在乳腺癌中存在复杂而密切的关联，探讨其关系有助于进一步了解乳腺癌发生发展过程中的分子事件，为指导治疗和评估预后提供帮助。
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