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晏益民，肖路，刘艳杰
(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所，吉林 长春 130102；
2.中国科学院大学，北京 100049)
大豆(Glycinemax)原产于中国，广泛栽培于世界各地。目前，我国对大豆的需求量逐年增加，但是国内大豆产量与需求之间缺口日益增大[1]。如何提高国内大豆产量，增加自给率，成为保障我国粮食安全的核心问题。东北地区大豆种植面积占全国大豆种植面积的41.4%，是我国大豆种植的三大主产区之一[2-3]。受市场需求和耕地面积的影响，东北地区普遍存在大豆重茬现象，大豆重茬种植导致大豆减产幅度为6.2%～35.4%[4]。因为大豆是对重茬种植不耐受的典型作物，故重茬障碍成为制约东北地区大豆产量的关键问题之一[5]。
大豆重茬种植会改变土壤结构与理化性质，如重茬三年后，土壤>5 mm机械稳定性团聚体数量、pH值、有机质、有机碳及土壤肥力等均出现下降现象[6-7]。并且大豆重茬会提高病虫害(如大豆胞囊线虫病、根腐病、根潜蝇病等)的发生频率[8]。此外，李业成等[9]研究指出，大豆根系分泌物会抑制大豆种子的萌发和初生根生长。并且重茬会增加根系分泌物的种类和数量，由此加重对大豆萌发和生长的抑制作用。大豆重茬种植过程中，土壤微生物群落结构发生变化是导致大豆减产的生物因素之一[10]。大豆和禾本科谷物(如玉米)轮作是解决大豆重茬减产的主要途径[11]，因禾本科作物创造的土壤环境有利于大豆的生长[12-13]。这种前茬作物改变土壤理化性质和生物群落结构，进而影响后茬作物生长的过程也被称为前茬作物的土壤遗留效应(Soil legacy effect)[14]。尽管，已有大量研究探讨禾本科作为前茬作物如何影响土壤结构和土壤微生物群落特征，进而影响大豆的生长和产量[4,15-17]。但是，对于如何提高大豆对重茬的耐受能力，降低重茬引发的大豆病虫害减产方面的研究仍显不足。
野生近缘种是天然的基因库，对拓宽作物狭窄的遗传基础、提高作物抗逆育种具有重要价值[18]。野生大豆(Glycinesoja)是大豆的野生近缘种，能够提供多种耐重茬基因[19]，从而减少大豆重茬种植造成的产量损失。如Eom等[20]指出包括野生大豆在内的野生豆科物种能够通过改变根际微生物群落而比栽培物种具有更高的抗病性。Tian等[21]也在研究中发现，重茬大豆致病菌(如：Spizellomyces)相对丰度要远高于野生大豆，并且野生大豆善于招募有益菌株(如：Orbiliaceae)用来抵御土壤线虫对根的伤害。此外，不同前茬作物会改变土壤理化结构和微生物组成，对作物产量和品质具有不同影响。因此，探讨大豆和野生大豆对前茬作物土壤遗留效应的响应，将为大豆培育耐重茬品种提供参考。本研究利用温室控制实验，通过大豆和野生大豆的盆栽种植，研究玉米和大豆前茬作物土壤遗留效应对大豆和野生大豆生长的影响，探索大豆和野生大豆在耐重茬方面的生态学机制。
1.1 试验材料
本试验野生大豆种子采集于中国科学院东北地理与农业生态研究所(长春)园区(43°59′49″N，125°24′3″E)；
栽培大豆种子由该所大豆分子设计育种重点实验室提供，分别是东生7号，东生9号和合丰55号。试验中所使用的土壤取自园区内连续种植大豆和玉米2年以上的实验田，其土壤类型为黑土[21](pH为6.2，有效磷为80.9 mg·kg-1，有效氮为111.2 mg·kg-1，有效钾为76.7 mg·kg-1，有机质为51 g·kg-1)，分别从上述大豆和玉米实验田取表层土壤(0～20 cm)备用。试验中用到的圆形塑料花盆高14 cm，顶部直径为15 cm，容积为2.5 L。
1.2 试验设计与方法
本试验开展时间为2020年11月至2021年2月，地点为中国科学院东北地理与农业生态研究所4号温室(43°59′49″N,125°24′3″E)。采用三因素完全交互设计，因素一是不同大豆品种：如图1所示包括A野生大豆，B栽培大豆东生7号，C栽培大豆东生9号，D栽培大豆合丰55号；
因素二为种植不同前茬作物(大豆和玉米)的土壤；
因素三是土壤是否经过辐射灭菌处理。首先将取自长期进行大豆和玉米种植试验田的土壤一分为二，其中一部分保存于4 ℃冰箱中备用，另一部分进行为期4天、剂量为25 kGy的γ射线灭菌处理，灭菌地点为长春市中核同辐北方基地。灭菌后，所有花盆中基质按照2份原土：1份砂子：1份蛭石的比例进行混合。每个处理设置8个重复，共计128盆(图1)。
注：图中A代表野生大豆，B代表东生7号，C代表东生9号，D代表合丰55号。辐射符号表示土壤被辐射灭菌。
2020年11月15日，分别挑选大小一致且无虫食的野生大豆、东生7号、东生9号和合丰55号栽培大豆种子各64粒。然后，对野生大豆种子进行98%浓硫酸处理10分钟，以打破种子的物理休眠促使其萌发[22]。然后，将栽培大豆和野生大豆种子用75%酒精进行杀菌处理并用无菌水洗涤3次，置于草炭土基质的育苗盘进行萌发。待萌发生长两周后，选取长势一致且健康的单株幼苗分别移栽到装好混合基质的128个花盆中。为了降低土壤养分对实验结果的影响，每个花盆中添加5 g奥绿缓释肥(Osmocote®Exact Standard; 15% N+9.0% P2O5+12% K2O+2.0% MgO+0.02% B+0.05% Cu+0.45% Fe+0.09% chelated by EDTA+0.06% Mn+0.02% Mo+0.015% Zn,Everris International B.V.,Geldermalsen,The Netherlands)。所有试验花盆被随机放置在温室中，在移栽幼苗5周后重新随机放置，以最大限度地减少位置效应对试验结果的影响。试验过程中，为保证土壤水分不限制植物生长，每天浇水100ml并使用HydraGO便携式土壤三参数测定仪(Stevens Water Monitoring Systems，Inc.)对土壤湿度进行测定，以保证土壤水分充足。由于试验阶段为冬季，日照时间不足，利用人工光源对植株进行早晚补光，提供每天15 h光照和9 h黑暗的光周期环境。在移栽幼苗后第9周，收获植株的地上部分和地下部分的生物量，由于1盆野生大豆试验过程中途死亡，最终收获127盆植株。所有植株按地上和地下部分收获，65 ℃烘干72小时，称重。
1.3 测定方法和指标
1.3.1 测定方法。实验分别测定野生大豆和栽培大豆(东生7号、东生9号和合丰55号)的地上生物量、地下生物量、扫描叶片表面积、扫描叶片干重、扫描根长、扫描根干重。地上和地下生物量以及扫描叶片重和扫描根干重采用电子天平称量。叶面积采用Canon Lide 220扫描仪扫描，并在ImageJ进行叶面积分析。根长首先采用Epson Expression 12000 XL扫描仪扫描，再用WinRhizo软件进行根长分析。
1.3.2 计算指标。
总生物量(g)=地上生物量+地下生物量
根质量分数(%)=地下生物量/总生物量×100%
比叶面积(cm2·g-1)=扫描叶片表面积/扫描叶片干重
比根长(m·g-1)=扫描根长/扫描根干重
1.4 数据分析
采用R统计软件nlme包中的线性混合模型(LME)和卡方检验(LRT)，分析前茬作物土壤处理、土壤灭菌处理及其相互作用对大豆和野生大豆生长的影响，并比较其差异显著性。模型中栽培大豆和野生大豆的总生物量、比叶面积、比根长和根质量分数为因变量；
固定因子为品种(栽培大豆与野生大豆)、不同前茬作物土壤(大豆栽培土与玉米栽培土)和土壤灭菌处理(是与否)；
考虑到野生大豆和栽培大豆品种个体的非独立性，在所有模型中都将栽培大豆品种和野生大豆的编码(即东生7号、东生9号、合丰55号和野生大豆)作为随机因子。为了满足残差正态性和方差齐性的假设，对模型中响应变量的数据进行了对数转化。以上统计均在R4.0.4[23]中完成，P<0.05为差异显著。
土壤灭菌处理对栽培大豆和野生大豆的总生物量、根质量分数、比叶面积和比根长均具有显著的影响(表1)。如图2所示，与灭菌土相比，未灭菌土显著降低了栽培大豆和野生大豆总生物量和比根长，而增加了比叶面积和根质量分数(P<0.05)。如表1所示，前茬作物对总生物量、根质量分数和比根长具有显著的影响。与玉米栽培土相比，大豆栽培土显著降低了栽培大豆和野生大豆总生物量(图2)，而使根质量分数和比根长显著增加(图2)，即重茬促使了生物量向根系的分配。整体而言，栽培大豆生物量显著高于野生大豆，而比叶面积则显著低于野生大豆。
灭菌处理与品种对生物量的影响存在显著的交互作用(表1)。相比较于非灭菌，灭菌对栽培大豆总生物量增加高达40.5%，而野生大豆总生物量增加仅为1.6%(图2)。这一结果说明，前茬作物通过土壤微生物对栽培大豆和野生大豆的生长产生抑制作用，并对栽培大豆生长的影响比野生大豆更明显。此外，不同前茬作物土壤(大豆栽培土vs.玉米栽培土)与品种(栽培大豆vs.野生大豆)对比叶面积影响的存在显著交互作用(P<0.05)(表1)，相比较于前茬作物为大豆时，玉米栽培土会使野生大豆的比叶面积减小27.3%，而栽培大豆比叶面积仅增加4.5%(图2)。这说明野生大豆会及时调整叶片形态以应对不同前茬作物处理下的土壤环境变化。
表1 不同前茬作物土壤和土壤灭菌处理及其相互作用对栽培大豆和野生大豆的总生物量、根质量分数、比叶面积、比根长的影响线性模型分析结果(LMEs)
图2 不同处理对栽培大豆与野生大豆性状指标的影响
重茬严重制约大豆生物量的积累。许艳丽等[24]研究指出重茬导致大豆干物质积累总量下降，且随重茬年限加长而下降幅度增大。产生这一现象的原因有以下几个方面：一方面是大豆重茬使土壤pH、含水量、有机质等显著下降，进而影响了大豆的生长[25-27]；
另一方面是遗留在土壤的自身代谢分泌物会对大豆产生自毒作用。Guenzi等[28]研究指出植物根系分泌和植物残茬分解产生的毒素是导致作物重茬障碍的重要因子；
再一方面，大豆重茬加剧土壤中土传病菌的积累和大豆根腐病、大豆胞囊线虫及根潜蝇等病害的发生[4]，进而抑制了大豆生物量的积累。这与本研究中灭菌土中大豆生物量显著高于非灭菌土的结果是一致的。农业上常用轮作的方式来降低重茬对大豆生长的影响。陈乃实等[29]研究指出相较于大豆重茬而言，玉米-大豆轮作能够显著促进大豆根际土壤中微生物多样性，土壤酶活性增加，可有效抑制大豆种植过程中病虫草害，优化土壤环境，实现农田土壤的可持续利用。土壤灭菌处理能够杀灭绝大部分的真核生物和原核生物[29]，从而抑制因重茬而导致土传病害的发生[30]。土壤病原微生物会增加根质量分数，使生物量倾向于地下分配，降低植株光合作用下干物质量积累速率。本研究中栽培大豆和野生大豆总生物量对灭菌处理的响应不同，这可能是因为野生大豆能够招募更多的有益微生物来抵御病原菌[21,31]，进而对不同土壤微生物群落具有更强的适应能力。
此外，重茬也增加了栽培大豆生物量向根系的分配。本研究结果显示重茬显著增加了栽培大豆和野生大豆的根质量分数和比根长。王晶英等[32]在研究连作年限分别为3年、4年和6年后也发现重茬增加了大豆根冠比。其可能原因是大豆重茬加重了病虫害，磷、钾等元素大量缺失，水分胁迫加重以及内源激素比例发生了变化[32]。在逆境条件下，栽培大豆需要向地下分配更多的生物量用于吸收养分。此外，本研究发现重茬使栽培大豆和野生大豆比叶面均增加，野生大豆比叶面积增大幅度远大于栽培大豆，这说明野生大豆在面对大豆重茬所造成的胁迫时，会及时调整叶片形态抵御逆境，其叶片功能性状具有更强的可塑性[30]。
重茬是影响大豆生产的主要障碍，会导致大豆生长迟缓、病虫害加剧和产量及品质下降等问题。田艺心等[33]对于解决我国大豆重茬问题提出一系列措施：调节土壤环境，采用间、套作的耕作方式，种子外加包衣，防治病虫害，加强田间管理等。然而，大豆重茬种植过程中的自毒作用和土传病害等问题并没有得到根本上的解决。长期处于自然环境下的野生大豆，保持着更高水平的遗传多样性，对于土壤病害有着更强的耐受性[34]。利用野生大豆的多种抗性性状都有可能提升栽培大豆对重茬的耐受能力[35]，减少重茬引发的病虫害所造成的产量损失。如开发野生大豆中大豆胞囊线虫、蚜虫、大豆潜叶蝇和大豆根腐病的抗性基因[36-37]，以提高栽培大豆重茬过程中的抗病能力。本研究发现在重茬胁迫下，野生大豆比栽培大豆具有更强的土壤病原微生物耐受能力和根系与叶片可塑性，有望为今后培育大豆耐重茬新品种提供参考。
大豆重茬所带来的土壤遗留效应会抑制栽培大豆和野生大豆的生长，这其中土壤病原微生物的存在能够显著抑制栽培大豆和野生大豆的生长和发育。而换茬(玉米)和土壤灭菌都能够显著促进栽培大豆生长。这也是利用轮作可以解决大豆重茬种植问题的理论基础。同时野生大豆在应对大豆重茬胁迫是能够通过改变叶片形态，实现更强的适应性；
而且对土壤病原微生物也表现出更强的耐受能力。通过寻找栽培大豆与野生大豆对环境胁迫的差异性表达，进而利用传统和分子育种技术，将野生大豆优良耐重茬的基因整合到栽培大豆中，对东北地区大豆培育耐重茬品种具有重要意义。
