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陈晓媚 马圆媛 聂 静 朱风新
(南方医科大学南方医院肾内科，广州 510000 )
急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)是由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的临床综合征，具有高发病率和高病死率。流行病学研究[1]显示，目前我国每年大约有300万患者发生AKI，与未发生AKI的人群相比，AKI患者患慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的风险增加8.8倍，患终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)的风险增加3.1倍。延缓AKI向CKD的进展，将缩短患者住院时间，降低患者的病死率和医疗负担。但目前关于AKI向CKD转化的确切机制还未完全阐明。肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells, RTECs)是肾脏功能最主要的执行者，也是AKI最主要的受损细胞。损伤较轻时，存留下来的RTECs出现短暂的适应性再生表型，通过增殖与分化产生成熟的RTECs，进而使肾功能得以恢复；
当损伤较重或持续存在时，RTECs则进行不恰当的修复，不能完成正常的增殖分化，并持续分泌炎性因子和促纤维化因子，直至死亡，从而导致肾脏结构不可逆性破坏[2]。因此，RTECs的损伤和修复是影响AKI转归的核心环节。本文将从细胞死亡、RTECs损伤后适应不良性修复机制、与其他细胞之间的对话3个方面，综述RTECs损伤修复的作用及机制的最新进展。
RTECs的死亡是公认的促进AKI发生发展的中心环节。既往研究[3-4]证实凋亡和坏死是RTECs的死亡形式。调节性坏死(regulated necrosis, RN)，定义为受到信号通路高度调控且具有坏死的形态学特征的非凋亡性细胞死亡途径[5]。RN的共同终点是细胞膜破裂和损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)释放，导致炎症激活。RN有几种形式：坏死性凋亡、细胞焦亡、铁死亡等。近年研究[6]证实AKI中RTECs发生RN。
1.1 坏死性凋亡
坏死性凋亡是一种由受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)、RIPK3和混合系激酶区域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)介导的程序性细胞坏死。机制上，坏死性凋亡最主要的触发因子是肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)，也可由TNF-α死亡配体家族的其他成员引起，如Fas配体、干扰素(interferon, IFN)等[7]。当TNF-α与其受体结合时，受体相关复合物聚集，RIPK1和RIPK3通过与RIP同型相互作用基序相互作用导致RIPK3的磷酸化和激活。接着，RIPK3催化MLKL的磷酸化和低聚化，由此诱导分子开关，导致细胞膜破裂和细胞死亡，促进了坏死性凋亡信号转导[8-9]。在肾脏，给予RIPK1抑制剂necrostatin-1(Nec-1)可缓解由缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)诱导的AKI，首次证实坏死性凋亡参与AKI的发生[10]。后来陆续发现坏死性凋亡在顺铂、横纹肌溶解、叶酸等多种因素诱导的AKI中均发挥作用。Chen等[11]研究发现，抑制RTECs的坏死性凋亡，可显著减少肾间质巨噬细胞浸润，降低IRI后持续的炎症反应，不仅可以改善AKI，还可以延缓AKI向CKD的进展。且在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)的小鼠CKD模型中也发现，RTECs的坏死性凋亡促进肾间质纤维化的发生发展[12]。因此，靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路可以作为AKI及肾脏纤维化的治疗靶点。目前多种坏死性调节抑制剂已作为抗癌药物进入临床试验，但其相关毒副作用是否适用于肾脏疾病患者仍有待观察。
1.2 细胞焦亡
细胞焦亡是一种由成孔蛋白Gasdermin介导的炎性程序性细胞坏死。研究[13-14]显示，细胞焦亡期间，细胞内炎症小体形成并活化，激活caspase-1和caspase-11，进而对白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和IL-18前体进行切割，形成有活性的IL-1β/18，诱导炎症反应。近来研究[15]证实，caspase-1和caspase-11均可切割Gasdermin D(GSDMD)，后者释放形成质膜孔道的N端活性片段，导致渗透性肿胀和细胞膜破裂，并迅速释放胞质内容物，促进细胞焦亡发生。在顺铂或IRI诱导的AKI动物模型中，caspase-1/11-GSDMD依赖地RTECs焦亡触发肾小管损伤、尿IL-18的排泄以及肾功能的恶化[16]。因此，GSDMD的切割及IL-1β和IL-18前体的切割活化是细胞焦亡的关键信号。近年来的研究[17]证实，RTECs焦亡参与了肾间质纤维化的发生发展。在敲除NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)基因的小鼠UUO模型中，活化的caspase1/IL-1β/IL-18显著降低，肾间质纤维化明显改善。
GSDMD的切割并不是细胞焦亡的唯一“杀手锏”，Gasdermin E(GSDME)经caspase-3切割后释放的N端片段，也可导致细胞焦亡。2021年有研究[18-19]显示，GSDME切割后的N端在顺铂诱导的AKI模型及UUO和5/6肾切除术(5/6 nephrectomy, 5/6Nx)诱导的CKD模型中表达均显著升高，且GSDME缺失或药物抑制对肾脏炎症反应、肾功能损伤和肾间质纤维化均有缓解作用，证明GSDME在AKI及AKI到CKD的进程中均发挥了作用。但目前仍缺乏关于RTECs焦亡的分子机制和作用的研究。
1.3 铁死亡
铁死亡是一种新型的铁依赖性的细胞死亡方式，以细胞内铁超载、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)耗竭和胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄积导致脂质过氧化物大量堆积为主要特征[20]。铁死亡的关键媒介包括胱氨酸/谷氨酸反向转运体(System Xc-)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)。研究[21]显示，GPX4敲除引起脂质过氧化蓄积，导致RTECs发生铁死亡，从而诱发自发性AKI。后来，在包括IRI、顺铂、叶酸、横纹肌溶解等多种原因诱导的AKI模型中，陆续证实RTECs确实存在铁死亡，并且目前认为在叶酸诱导的AKI小鼠模型中，铁死亡是肾小管细胞的主要死亡方式[22]。Yang等[23]发现抑制铁死亡可显著减轻小鼠UUO模型中的肾间质纤维化。但是，关于铁死亡发挥效应的确切分子机制还有待进一步完善。
AKI发生后，如果损伤因素持续存在，则RTECs修复不良，出现线粒体功能障碍、细胞周期阻滞和细胞衰老，以及上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，诱发肾间质持续性炎症反应，促进肾间质纤维化。
2.1 线粒体功能障碍
肾小管具有强大的重吸收功能，大约70%的肾小球滤液及其溶质在近端小管重吸收[24]。AKI发生后，RTECs线粒体出现不同程度的功能障碍，表现为线粒体生物合成、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)、线粒体动力学异常，导致线粒体膜电位下降、ROS产生增加，以及炎症反应的加重。线粒体功能障碍持续存在可诱导AKI逐渐发展为CKD。
2.1.1 线粒体生物发生受损
过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha, PGC-1α)是线粒体生物发生的主要调控分子[25]。PGC-1α通过刺激线粒体生物发生，以维持线粒体数量和功能的稳定。RTECs主要依靠线粒体脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO)作为燃料来源并通过OXPHOS产生ATP。在小鼠AKI和CKD模型中均观察到PGC-1α表达降低，在人CKD肾活检标本和小鼠肾间质纤维化模型中，FAO的关键酶及关键转录调节因子表达均下调，相反，增加RTECs中PGC-1α的表达可以改善线粒体生物发生和OXPHOS，改善肾脏疾病进程。并且在动物模型中给予FAO激动剂非诺贝特可减轻肾间质纤维化[26-29]，提示尽早恢复FAO可以一定程度上延缓AKI向CKD的转化。通过对不同培养条件下的肾脏类器官进行单细胞RNA测序分析，发现在促进OXPHOS发生的培养基中，PGC-1α及脂质代谢基因表达更高，且在该培养条件下，近端肾小管细胞(proximal tubular cells, PTCs)的细胞标志物表达更高[30]，提示FAO和OXPHOS是细胞分化的直接驱动因素。综上，PGC-1α通过协调线粒体生物发生和FAO之间的复杂网络，介导AKI的发生发展，并在AKI向CKD的转化过程中起一定作用。
2.1.2 线粒体动力学紊乱
线粒体是一种动态的细胞器，通过融合和裂变的微妙平衡以及线粒体自噬来维持其形态及稳定数量和质量。线粒体动态平衡受多种蛋白质调节，包括动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1, DRP1)、线粒体裂变蛋白1、线粒体裂变因子、线粒体融合蛋白1/2和视神经萎缩蛋白等[31]。Brooks等[32]首次提出线粒体断裂是先于凋亡发生的AKI早期事件。本课题组进一步发现，在顺铂诱导的AKI小鼠模型中，Numb蛋白缺失通过增加DRP1在丝氨酸656残基的磷酸化，加速DRP1向线粒体的募集，进而加重线粒体断裂；
给予DRP1的药物抑制剂mdivi-1可减轻顺铂诱导的肾小管损伤和肾功能障碍[33]。因此，线粒体动力学的调节可能为防治AKI提供新视角。
2.1.3 线粒体功能障碍与炎症反应
研究[34-36]证实，线粒体损伤可引起炎症反应促进AKI发展为CKD。在这一过程中，环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)-干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)通路起着至关重要的作用[37-38]。在顺铂诱导的AKI小鼠模型中，线粒体DNA(mtDNA)泄漏到细胞质中激活cGAS/STING通路，敲低STING可显著减轻mtDNA诱导的炎症反应和肾脏损伤[38]，提示cGAS/STING通路参与AKI的发生发展。肾小管特异性缺失线粒体转录因子A小鼠的RTECs中线粒体功能显著缺陷，并在6周龄时即出现肾间质纤维化，间质炎性细胞浸润，敲除STING或药物抑制STING活性，可减少肾间质炎性细胞浸润，改善肾间质纤维化[39]，提示除熟知的DNA病毒等，mtDNA也可以激活cGAS/STING轴，从而导致慢性炎症反应，加重肾脏损伤，为线粒体损伤参与肾脏疾病提供新的思路。
2.2 细胞周期阻滞
当细胞在外界因素的作用下出现DNA损伤时，细胞周期中断，细胞将不能从上一个阶段通过细胞周期检查点进入下一个阶段，这种现象称为细胞周期阻滞[40]。在G1期，细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(cyclin-dependent kinases 4 and 6, CDK4/6)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)形成的复合物磷酸化视网膜母细胞瘤抑制蛋白(retinoblastoma protein, Rb)，解除后者对转录因子E2F的抑制作用，使细胞正向进入细胞周期，活化的E2F促进CDK2与Cyclin E结合，又进一步磷酸化Rb。DiRocco等[41]发现，在顺铂或IRI诱导的AKI小鼠模型中，给予CDK4/6的小分子抑制剂PD 0332991抑制CDK4/6，诱导短暂的G0/G1阻滞，可减轻RTECs损伤，减少肾间质炎症细胞浸润。然而，G2/M阻滞是AKI进展为CKD的重要机制，Yang等[42]在急慢性肾损伤模型中均发现RTECs受损后阻滞于G2/M期，激活c-Jun氨基末端激酶信号通路，上调转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和结缔组织因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表达，促进肾间质炎症浸润和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积，导致肾间质纤维化。本课题组以往的研究[43]揭示，在UUO模型中，PTCs中Numb的表达上调，在体外培养的PTCs中过表达Numb导致更多的细胞停留在G2/M期并上调TGF-β1和CTGF的表达，PTCs特异性地敲除Numb可以抑制G2/M阻滞，减轻肾间质纤维化。本团队新的研究[44]进一步显示Numb过表达可以升高缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)的蛋白水平，沉默HIF-1α可以阻断Numb过表达诱导的PTCs的G2/M阻滞。值得注意的是，处于周期阻滞的RTECs可出现细胞衰老并丧失增殖能力。衰老的细胞同时伴有细胞表型的变化，表现为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP),通过自分泌和旁分泌方式释放促炎因子和细胞外基质等，影响自身或临近的细胞。2019年，Canaud等[45]发现了一种新的不典型的细胞周期蛋白(Cyclin G1)，观察到阻滞于G2/M期的RTECs中Cyclin G1的表达升高，促进雷帕霉素-自噬空间耦合室的靶点的形成，诱导促纤维化因子的分泌，出现类似于SASP的变化，从而促进肾间质纤维化。综上，RTECs周期阻滞和衰老在AKI向CKD的转变中发挥重要作用。虽然目前关于调控RTECs周期阻滞的关键分子的研究已经很多，但这些分子对RTECs周期阻滞的具体调控信号通路仍尚未清楚，这是值得我们进一步去思考和探索的问题。
2.3 上皮-间充质转化
上皮-间充质转化是指完全分化的上皮细胞向成纤维细胞表型转变的过程，包括增强的迁移能力、侵袭性，以及生成过量的ECM。以往的研究[46]显示，发生EMT的RTECs是活化的肌成纤维细胞的重要来源。Iwano等[47]在小鼠UUO模型的肾脏中，通过细胞谱系追踪实验，证实肾间质36%的成纤维细胞特异蛋白-1(fibroblast-specific protein-1, FSP-1)(+)成纤维细胞是由PTCs转化而来。而且在糖尿病肾病、5/6Nx、慢性移植肾病等的动物模型及人肾脏活检标本中均发现了RTECs EMT的证据。然而，Zeisberg等[48]和LeBleu等[49]用类似的细胞示踪技术，证实大多数经EMT而来的肌成纤维细胞实际上是由血管内皮细胞转化而来，由RTECs转化而来的仅占5%。因此，RTECs的EMT是否是活化的肌成纤维细胞的重要来源仍存在争议。近年来，不少研究者[50-51]观察到受损的RTECs能同时表达上皮细胞和间充质细胞的标志物，但RTECs并不直接迁移到肾间质，而是分泌促纤维化因子，传递至肾间质，诱导肌成纤维细胞活化，导致肾间质纤维化，这一现象被称为部分EMT(partial EMT)。Lovisa等[51]发现，过表达正向调控EMT的转录因子Twist1或Snail1，可以诱导RTECs发生partial EMT，同时细胞出现G2/M阻滞。此外，研究[52-53]证实多个细胞内信号传导通路，包括TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin和Notch等信号通路，在EMT中发挥调控作用。Pyo等[54]的研究表明，长期暴露于赭曲霉素A(ochratoxin A)的肾脏可出现EMT，进一步在体内和体外模型中发现，ochratoxin A是通过TGF-β1/Smad2/3和Wnt1/β-catenin信号通路诱导RTECs发生EMT，进而引起肾间质纤维化。因此，EMT在AKI的损伤后不良修复及肾间质纤维化中可能起着重要的作用。值得注意的是，目前学者们对于EMT的认识仍存在争议，未来的研究方向仍是寻找更加确凿的证据来证明EMT的重要性。
现已明确，AKI发生后，受损的RTECs与肾间质其他固有细胞，如炎症细胞和成纤维细胞之间的交流介导AKI的发展，促进AKI发展为CKD。
3.1 RTECs与巨噬细胞之间的对话
AKI后持续存在的慢性炎症反应是AKI向CKD转化的重要推手，肾间质炎症细胞的浸润和活化是AKI后炎症发生的主要途径，而巨噬细胞是促进肾脏炎症和纤维化的主要炎症细胞。近年来，实验[55]证实，RTECs与巨噬细胞之间的交流在RTECs的损伤与修复中发挥重要作用。受损的RTECs可分泌TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子，招募巨噬细胞进入损伤部位，导致损伤小管局部微环境的变化，从而进一步促进肾小管损伤[56]。Lv等[57]发现在小鼠肾损伤模型和IgA肾病患者中富含趋化因子配体2(c-c motif chemokine ligand 2, CCL2) mRNA的外泌体从RTECs向巨噬细胞传递炎症信号，最终导致巨噬细胞的激活和迁移，进而促进了肾小管间质炎症，提示RTECs与巨噬细胞之间可通过外泌体进行细胞间通讯。有趣的是，RTECs与巨噬细胞之间的作用并不仅仅是单向的。蒋文娟等[58]发现RTECs来源地富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(leucine-rich-alpha-2-glycoprotein-1, LRG1)的外泌体以转化生长因子-β受体1(transforming growth factor-beta recepter 1，TGF-βR1)依赖的方式激活巨噬细胞，并诱导巨噬细胞释放富含TNF-α相关凋亡诱导配体的外泌体，通过死亡受体5信号途径诱导受损的RTECs细胞发生凋亡。总之，RTECs与巨噬细胞之间的对话使肾间质炎症反应不断升级，致使损伤的肾小管不能正常修复，最终发展为肾间质纤维化。
3.2 RTECs与成纤维细胞之间的对话
RTECs在适应性不良修复过程中常伴随着大量促纤维化因子的表达，包括：TGF-β1、CTGF和Wnt等，他们可作用于成纤维细胞，诱导其转化为肌成纤维细胞，活化的肌成纤维细胞进一步增殖并合成和分泌大量的ECM，促进肾间质纤维化的发展[59]。因此，RTECs与成纤维细胞之间的对话在AKI向CKD进展中具有重要意义。Hong等[60]观察到RTECs来源的LRG1可以增加肾小管细胞中TGF-β/Smad3信号级联，并以旁分泌方式增强间质中成纤维细胞的TGF-β介导的Smad3激活，进而诱导促纤维化基因的表达，促进肾小管间质纤维化。同时，活化的肌成纤维细胞也可以反过来加重RTECs的损伤。在UUO模型中，成纤维细胞特异性过表达丝氨酸/苏氨酸激酶90 000核糖体蛋白S6激酶1(Ser/Thr kinase 90 000 ribosomal protein S6 kinase 1, p90RSK)的小鼠，通过ROS激活β-catenin/FOXO1信号通路，诱导RTECs凋亡，促进肾间质纤维化[61]。Zhou等[62]发现，经TGF-β1处理的成纤维细胞的细胞培养基中分离出的微囊泡中，miR-34a显著上调，这些微囊泡将上调的miR-34a从成纤维细胞传递到RTECs，诱导RTECs发生凋亡。综上，在AKI向CKD转化中，RTECs和成纤维细胞之间存在串扰，这种串扰主要是通过促炎因子和促纤维化因子实现的，这也引起研究者的进一步思考，是否对这些相关因子进行干预就可以有效阻断AKI向CKD的转变？
综上，AKI后受损的RTECs启动适应性不良修复过程以促进向CKD转变，其中涉及的机制极其复杂，既包括细胞自身的病理生理变化，还包括细胞与细胞之间的相互作用。特别地，关于RTECs的线粒体功能障碍方面的研究已经越来越深入，未来的重点应是为这些潜在的治疗靶点寻找更多的临床证据。另外，对于一些仍然存在争议的机制，比如上皮间充质转化，未来的研究应更致力于通过应用一些新的技术，例如单细胞组学、类器官模型等，深入了解RTECs损伤后的动态变化过程，以期对这些机制有更加深刻的认识和理解。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明陈晓媚、马圆媛：论文撰写；
聂静、朱风新：研究指导、论文修改、经费支持。
