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毕敬豆， 穆怡含， 张钰瑶， 李 灵 ， 邓小宽， 高 平 ， 周鹏程 ， 蒋学瑛， 蒋小红， 刘 竞， 陈海琼
(1.四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室， 成都 610065；
2.四川省通世达生物科技有限公司 资阳市院士(专家)工作站， 资阳 641500)
蚕沙(Faeces Bombycis)，我国传统虫类中药，始载于《名医别录》，是蚕蛾科家蚕属昆虫家蚕(BombyxmoriLinnaeus)幼虫的干燥粪便[1,2].蚕沙是桑蚕产业的主要副产物之一，主产地有浙江、江苏、四川等省份.《本草纲目》中记载[3]蚕沙具有祛风除湿、和胃化湿、清热明目、活血定痛的功效.现代药理研究表明蚕沙中的活性成分包括黄酮类、生物碱类、萜类、香豆素类等[4]，其提取物具有促进骨髓造血[5]、抗肿瘤[6]、抗氧化、降低人体胆固醇含量[7]、降血糖[8]、抗炎[9]和镇痛[10]等活性.临床上蚕沙常作为治疗糖尿病和类风湿性关节炎的常用药物[11]，研究证明其主要降糖成分为1-脱氧野尻霉素，效果显著.因此，该中药具有较高的营养价值和药用价值.
蚕沙中富含叶绿素，是食品工业中天然着色剂的良好来源[12].20世纪六七十年代研究者便开始利用蚕沙提取叶绿素，相比较从高等植物中提取叶绿素，蚕沙资源丰富，其中含量高达1%[13]，更易于工业化生产.在叶绿素生产过程中加碱皂化产生大量富含植物醇、类胡萝卜素和叶黄素[14]等物质的不皂化物，有研究者对生产叶绿素及铜钠盐后所得废液中的β-胡萝卜素[15,16]、果胶[17]及黄酮类化合物[18]提取工艺进行了相关报道，但对其中单体化合物并未有深入研究，且目前国内外关于蚕沙叶绿素不皂化物中的化学成分未见相关研究报道.
目前国内企业年产叶绿素100吨以上，每年积累几百吨不皂化物副产物，因此深入研究不皂化物中的化学成分具有重要意义.立足于蚕沙前期处理研究，本文重点探究蚕沙叶绿素不皂化物中的化学成分，为蚕沙资源的进一步综合利用提供研究资料，为后续相关产品的生产工艺研究开发提供理论依据.
2.1 材 料
2.1.1 原料 蚕沙叶绿素不皂化物(四川省通世达生物科技有限公司提供)；
豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、羽扇豆醇对照品(成都植标化纯生物技术有限公司).
2.1.2 试剂 石油醚(60～90)、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮(分析纯，成都科龙化工试剂厂)，甲醇(色谱纯，成都科龙化工试剂厂).
2.1.3 仪器 玻璃层析柱(150 mm×600 mm)；
R201D真空旋转蒸发仪(巩义英峪高科仪器厂)；
LC3000高效液相色谱仪(UV3000紫外检测器、P3000高压输液泵，北京创新通恒科技有限公司)；
Sepax Sapphire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；
MCI GEL(上海厦美生化科技发展有限公司)；
制备色谱柱(YMC-C18-10μm，北京创新通恒科技有限公司)；
MicrOTOFQⅡ(德国Bruker公司)；
Bruker AvanceⅡ-400MHz和Bruker AvanceⅡ-600MHz spectrometer(德国Bruker公司).
2.2 方 法
2.2.1 分离纯化 取400 g蚕沙叶绿素不皂化物用适量石油醚加热溶解，加入适量硅胶拌匀晾干，干法装柱，干法上样，敲击柱体，保证色谱层平整紧实.层析柱分别用石油醚/乙酸乙酯体积比(100∶0、 50∶1、 20∶1、 5∶1、 2∶1、 0∶1)梯度洗脱.收集洗脱液，经TLC追踪检测合并相同馏分，减压浓缩得到6个粗分段，分别为Fr.1(58 g)、Fr.2(42 g)、Fr.3(39 g)、Fr.4(24 g)、Fr.5(51 g)、Fr.6(15 g).Fr.1段石油醚结晶得到白色蜡状固体，经C18中压色谱柱分离得到高纯度化合物11.Fr.2段二次过硅胶柱，TLC检测回收得到Fr.2-A-D.经HPLC检测分析，合并AB和CD，得到Fr.2-AB(8.6 g)、Fr.2-CD(12.86 g)先后通过MCI柱粗分离，甲醇洗脱；
再重复多次经C18中压色谱柱分离，90%～100%甲醇洗脱，Fr.2-CD得到化合物1(1.6 g)，Fr.2-AB得到化合物2(145 mg).Fr.3段经硅胶柱分离，得到含有7～9三个化合物含量较多的两个粗组分Fr.3-A(19.67 g)和Fr.3-B(10.32 g).两个分段经过C18中压色谱柱和高压制备色谱柱进行细分离，均用90%～100%甲醇梯度洗脱，经过反复柱层析分离，HPLC检测，分别得到纯度较高的化合物7(320 mg)、8(600 mg)和9(31 mg).Fr.4经过TLC、HPLC检测对照品分析，富含甾醇类化合物3,4,5,6,10，先经MCI柱甲醇洗脱初步除杂，后进行C18中压色谱柱分离得到Fr.4-A,B,C.Fr.4-A经C18中压色谱柱，90%～100%甲醇洗脱，得到化合物3(1.39 g)，Fr.4-B经过多次C18中压色谱柱和高压制备色谱柱，90%～100%甲醇洗脱得到化合物10(73 mg)，Fr.4-C经过多次C18中压色谱柱分离得到化合物4(43 mg),5(40 mg),6(78 mg).Fr.5用乙醇、丙酮等溶剂结晶可得到大量化合物6.Fr.6经HPLC检测未发现含量较高的成分，故不再进行分离.
2.2.2 结构鉴定 本文通过分离纯化和重结晶得到高纯度的单体化合物，用氘代试剂溶解，利用质谱、核磁氢谱、碳谱等波谱技术进行测定.查阅文献，根据波谱数据和化合物的理化性质进行结构鉴定.
化合物1：淡黄色油状液体，ESI-MS at m/z:297.23[M-H]+.TLC结果显示该化合物和植物醇标品的Rf值和斑点形状一致.HPLC检测结果显示该化合物出峰时间与植物醇标品一致，且混合进样显示为同一物质，故化合物1鉴定为植物醇(Phytol)，分子式C20H40O.
化合物2：白色粉末，ESI-MS at m/z:427.98[M-H]+.1H-NMR(400HMz,DMSO)б:3.47(1H,t,J=3.11 Hz,H-3，-OH), 5.54、5.52 (1H,d,J=6 Hz,H-6,双键质子氢),0.98～1.16(3H,s,取代甲基氢),1.31～1.84(1H,m,质子氢取代).13C-NMR (101 MHz, DMSO)δ:18.02(C-1)，27.98(C-2),74.36(C-3),40.14(C-4),142.65(C-5),118.86(C-6),19.07(C-7),46.82(C-8),34.04(C-9),49.53(C-10),32.62(C-11),29.53(C-12),38.67(C-13),35.47(C-14),28.93(C-15),34.24(C-16),29.83(C-17),42.50(C-18),34.09(C-19),27.9(C-20),32.60(C-21),37.27(C-22),27.76(C-23),28.93(C-24),15.87(C-25),19.07(C-26),17.93(C-27),29.53(C-28),32.14(C-29),31.63(C-30).以上核磁数据与文献[19]基本一致，故化合物2鉴定为5-Glutinen-3-ol，分子式为C30H50O.
化合物3：白色羽状结晶，ESI-MS at m/z:427.12[M-H]+.1H-NMR(400HMz,CDCl3)б:4.57(d，J=2.6 Hz,H-20a)；
4.65(d，J=2.4 Hz,H-20b)；
3.20(dd，J=11.5，5.0 Hz，H-3)，0.74～1.71(3H，s，取代甲基氢).13C-NMR (101 MHz, CDCl3)δ:38.72(C-1)，27.46(C-2),79.01(C-3),38.87(C-4),55.31(C-5),18.02(C-6),34.29(C-7),40.84(C-8),50.45(C-9),37.18(C-10),20.94(C-11),25.15(C-12)，38.06(C-13)，43.01(C-14),28.00(C-15),35.60(C-16),42.84(C-17),48.31(C-18),48.00(C-19),150.99(C-20),29.86(C-21),40.02(C-22),29.71(C-23),15.39(C-24),15.99(C-25),16.13(C-26),14.56(C-27),18.33(C-28),109.34(C-29),19.32(C-30).以上核磁数据与文献[20]基本一致，故化合物3鉴定为羽扇豆醇(Lupeol)，分子式为C30H50O.
化合物4：白色粉末，ESI-MS at m/z:412.64[M-H]+.TLC结果显示该化合物与豆甾醇标准品的Rf值和斑点形状一致.HPLC检测结果显示该化合物的出峰时间与豆甾醇标准品一致，且混合进样显示是同一物质.故化合物4鉴定为豆甾醇(Stigmasterol)，分子式为C29H48O.
化合物5：白色粉末，ESI-MS at m/z:400.70[M-H]+.HPLC检测结果显示该化合物的出峰时间与菜油甾醇标准品一致，且混合进样显示为同一物质.故鉴定化合物5为菜油甾醇(Campesterol)，分子式C28H480.
化合物6：白色针状结晶，ESI-MS at m/z:415.12[M-H]+.TLC结果显示该化合物与β-谷甾醇标准品Rf值和斑点形状一致.HPLC检测结果显示该化合物的出峰时间与β-谷甾醇标准品一致，且混合进样为同一物质.故化合物6鉴定为β-谷甾醇(β-sitosterol)，分子式C29H50O.
化合物7：淡黄色油状液体，ESI-MS at m/z:430.51[M-H]+.1H-NMR(400 MHz,CDCl3)б:4.22(1H,s,-OH),2.5(2H,t,J=6.5 Hz,H-4),2.15(3H,s,H-10),2.11(6H,s,H-5a,H-7a),1.25(3H,m,H-2a),0.85(6H,m,H-12′a,H-13′),0.82(3H,m,H-8′a),0.83(3H,m,H-4′a).13C-NMR(101 MHz,CDC13)δ:75.4(C-2)，23.7(C-2a)，32.1(C-3)，20.6(C-4)，117.5(C-4a),118.8(C-5),11.9(C-5a),144.7(C-6),121.0(C-7),12.3(C-7a),122.4(C-8),145.6(C-8a),11.5(C-8b),39.7(C-1′),24.8(C-2′),37.3(C-3′,C-5′),32.9(C-4′),21.2(C-6′),37.3(C-7′,C-9′),32.6(C-8′),24.5(C-10′),39.6(C-11′),28.0(C-12′),22.5(C-12′a),22.3(C-13′),19.8(C-4′a),19.7(8′a).以上核磁数据与文献[21]基本一致, 故化合物7鉴定为α-生育酚 (α-tocopherol)，分子式为C29H50O2.
化合物8：淡黄色油状液体，ESI-MS at m/z:416.54[M-H]+.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ：4.20(1H,s,6-OH),1,67 (2H,m,H-3), 2,68 (2H,t,J= 7.3 Hz,H-4), 6,37(1H,s, H-5), 1,22-1,28 (2H，m，H-1′2′3′5′6′7′9′10′11′),0,83 (1H,d,J=6.7 Hz,H-4′,H-8′,H-12′,H-13′),1,23 (3H,s,H-2),2,12 (3H,s,H-7),2,09 (3H,s,H-8).13C-NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 75.48(C-2),31.40(C-3),22.34(C-4),112.14(C-5),146.23(C-6),121.61(C-7),125.81(C-8),145.76(C-9),118.32(C-10),40.05(C-1′),21.03(C-2′),37.47(C-3′),32.70(C-4′),37.30(C-5′),24.46(C-6′),37.48(C-7′),32.82(C-8′),37.44(C-9′),24.82(C-10′),39.39(C-11′),28.00(C-12′),22.65(C-13′),24.10(CH3-C-2),11.92(CH3-C-7),11.88(CH3-C-8),19.68(CH3-C-4′),19.77(CH3-C-8′),22.74(CH3-C-12′).以上核磁数据与文献[22]基本一致，故化合物8鉴定为γ-tocoferol，分子式C28H48O2.
化合物9：白色粉末，ESI-MS at m/z:427.7[M-H]+.1H-NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.44(1H,t,J=6.8 Hz,H-2),5.10(5H,t,J=7.1 Hz,H-6,H-10,H-11,H-18,H-22)，4.16(2H,d,J=6.9 Hz,H-1),2.09(10H,m,H-4,H-5,H-8,H-9,H-12),1.98(10H,m,H-13,H-16,H-17,H-20,H-21),1.67(3H,s,24-CH3),1.62(18H,s,C-3-CH3,C-7-CH3,C-11-CH3,C-15-CH3,C-19-CH3, C-23-CH3).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ:59.43(C-1),124.42,124.28,124.25,124.18,123.76,123.32(C-2,C-6,C-10,C-14,C-18,C-22),139.89,135.43,135.04,134.98,134.96,134.95(C-3,C-7,C-11,C-15,C-19,C-23),29.72,26.78,26.72,26.68,26.34(C-4,C-8,C-12,C-16,C-20),39.76,39.74,39.57(C-5,C-9,C-13,C-17,C-21),25.71(C-24),17.70,16.31,16.04,16.02(C-25,C-26,C-27,C-28,C-29,C-30).以上核磁数据与文献[23]基本一致，故化合物9鉴定为(2E,6E,10E,14E,18E,22E)-3,7,11,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22- tetracosahexaen-1-ol，分子式为C30H50O.
化合物10：白色蜡状固体,ESI-MS at m/z:427.6[M-H]+.1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.31(1H,t,J=6.8 Hz,H-7),5.13(1H,t,J=6.5 Hz,H-24),3.27(1H,dd,J=4.6,10.7 Hz,H-3),1.69(3H,s,CH3-26),1.60(3H,s,CH3-27),0.98(3H,s,CH3-29),0.99(3H,s,CH3-30),0.90(3H,s,CH3-28),0.89(3H，s，CH3-21)，0.83(3H,s,CH3-19)，0.77(3H,s,CH3-18).13C-NMR(101 MHz,CDCl3)δ:37.2(C-1),25.36(C-2),79.27(C-3),38.97(C-4),50.62(C-5),23.95(C-6),117.79(C-7),145.90(C-8),48.91(C-9),34.94(C-10),18.15(C-11),33.96(C-12),43.53(C-13),51.28(C-14),33.82(C-15),28.48(C-16),53.23(C-17),22.09(C-18),13.11(C-19),35.80(C-20),18.60(C-21),35.16(C-22),27.61(C-23),125.14(C-24),130.96(C-25),25.75(C-26),17.68(C-27),27.69(C-28),14.74(C-29),27.32(C-30).以上核磁数据与文献[24]基本一致，故化合物10鉴定为(13α,14β,17α,20R)-7,24-二烯羊毛甾烷-3-醇((13α,14β,17α,20R)-lanosta-7,24-diene-3-ol),分子式C30H50O.
化合物11：白色蜡状固体，ESI-MS at m/z:256.0[M-H]+,1H-NMR (400MHz,CDCl3)δ:2.36(2H,t,J=7.5 Hz,H-2),1.65(2H,m,H-3),1.27～1.32(22H, m,H-4～14),1.34(2H,m,H-15),0.90(3H,t,J=6.5 Hz,H-16).13C-NMR(101 MHz,CDCl3)δ:179.6(C-1),34.1(C-2),24.6(C-3),29.8-29.0(C-4-C-13),31.8(C-14),22.6(C-15),14.2(C-16).以上核磁数据与文献[25，26]基本一致，故化合物11鉴定为棕榈酸(palmitic acid)，分子式为C16H32O2.
图2 化合物1～11结构式Fig 2 Chemical structures of conpounds 1～11
经过分离纯化和结构鉴定，从蚕沙叶绿素不皂化物中分离得到11种化合物，包括6种甾醇类物质，2种萜类物质，2种生育酚及棕榈酸.其中化合物2,9,10为首次从蚕沙中分离得到.结果可知，蚕沙叶绿素不皂化物中富含甾醇类物质，其中，β-谷甾醇、豆甾醇是叶绿素不皂化物中两种主要的植物甾醇；
其次是菜油甾醇和羽扇豆醇，在众多的研究报道[27-29]中已经证实了它们具有抗炎、抗肿瘤和降低胆固醇等多种良好的药理活性，目前在食品、化妆品和医药领域都有着广泛应用.最后，本文研究首次在蚕沙中分离出两种新的甾醇类物质5-Glutinen-3-ol与(13,14,17,20R)-lanosta-7,24-diene-3-ol，对后续蚕沙中甾醇研究有着重要意义.
此外，维生素E是一种脂溶性维生素，有着抗氧化[30]、抗衰老[31]、预防动脉粥硬化等功效，蚕沙叶绿素不皂化物中分离的α-生育酚和γ-生育酚是维生素E的两种天然存在形式.植物醇也是维生素K合成中的重要原料.因此，蚕沙叶绿素不皂化物可作为生产甾醇类物质和维生素E、维生素K的材料来源.本文研究明确了不皂化物相关化学成分，为蚕沙生产叶绿素过程中产生的相关副产物的深度利用提供了研究资料.
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