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张润红 谢简珺 赵 丽
超声波辅助复合酶法提取核桃青皮总黄酮工艺研究
张润红谢简珺赵丽
（兰州石化职业技术大学甘肃兰州730000）
为寻求一种以水为溶剂高效提取核桃青皮总黄酮的最优工艺，以便后续核桃青皮堆肥归田还林，实验采用超声波辅助复合酶提取核桃青皮总黄酮进行研究。首先通过单因素实验分析了复合酶配比、浸取温度、料液比、浸取时间和浸取液pH等因素对核桃青皮总黄酮提取率的影响，然后利用响应面分析法优化提取工艺条件，最后通过三组平行实验验证优化结果。实验表明：在功率为100 W的超声环境中，当复合酶配比（果胶酶/纤维素酶）为1∶1，浸取温度为55 ℃，液料比（g/mL）为1∶35，浸取时间为30 min，浸取液pH为6时，总黄酮提取率最高，约为7.53％。
核桃青皮；
超声波；
复合酶；
总黄酮；
提取工艺
核桃青皮又称青龙衣，为核桃外部一层厚厚的绿色果皮，是核桃最主要的副产品。在核桃加工场所，会产生2倍以上干核桃的核桃青皮，数量较大。充分利用核桃青皮资源不但可以成为核桃产业新的经济增长点，还可以减少由于核桃青皮不合理处置产生的环境污染。目前，最理想的核桃青皮利用方式是先提取核桃青皮中的单宁、黄酮类、多酚类和萘醌等活性物质，然后将核桃青皮堆肥归田还林[1-3]。
黄酮类化合物是核桃青皮的次生代谢产物之一，具有抗氧化、抑菌、防止血管增生、抗病毒、降血糖、降血脂、抗骨质疏松、预防老年痴呆和脑出血等多种作用，利用价值较高[4-5]。本实验同时利用超声波产生的振荡力和高速、剧烈的空化效应以及生物酶解技术的破壁作用，加速细胞内成分的溶解、扩散，从而提取核桃青皮总黄酮[6]。首先考察复合酶配比、料液比、浸取温度、浸取液pH、浸取时间等单因素对总黄酮提取率的影响，然后选取对实验影响较大的三个因素进行响应面法优化分析，最终确定出最优提取工艺，为提取核桃青皮总黄酮提供科学依据。
1.1 材料与仪器
核桃青皮，产于甘肃庆阳；
芦丁标准品（纯度98％）、果胶酶（酶活力500 U/mg）、纤维素酶（酶活力50 U/mg），均购于上海源叶生物科技有限公司；
NaOH、无水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3，均为分析纯试剂。
AB-204-N型分析天平，瑞士Mettler公司；
PHS-4C+酸度计，成都世纪方舟科技有限公司；
H1850型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
KQ2200DB超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；
UV-1801型紫外/可见分光光度计，北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 核桃青皮的预处理
将新鲜的核桃青皮洗净后晒干[7]，去除杂质，粉碎，过40目筛，室温下储存于干燥器中备用。
1.2.2 芦丁标准曲线的建立
准确称取干燥至恒重的芦丁标准品6 mg，用80％的乙醇溶液溶解后定容至100 mL容量瓶，摇匀，即得质量浓度为0.06 g/L的芦丁标准储备液。准确移取芦丁标准储备液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，依次加入2.0 mL 5％的NaNO2溶液，摇匀静置6 min，再加入2.0 mL 10％的Al(NO3)3溶液，静置6 min，再加入20.0 mL 5％的NaOH溶液，用80％的乙醇溶液定容，混匀显色15 min，最后使用1 cm比色皿于510 nm处测定溶液的吸光值A。以溶液的吸光值A对芦丁的质量浓度作图，绘制芦丁标准曲线，拟合回归方程[8-10]。
1.2.3 总黄酮的提取及含量测定
准确称取核桃青皮粉末1.0 g、复合酶（纤维素酶＋果胶酶）0.04 g于100 mL圆底烧瓶中，置于功率为100 W的超声环境中分别在不同的复合酶配比、料液比、浸取温度、浸取液pH、浸取时间条件下用水浸取核桃青皮总黄酮，待浸取液冷却至室温后转移至100 mL容量瓶中定容备用。取一定量浸取液至离心杯中，在8 000 r/min的转速下离心10 min，取上清液3 mL于50 mL容量瓶中，依次加入2.0 mL 5％的NaNO2溶液，摇匀静置6 min，再加入2.0 mL 10％的Al(NO3)3溶液，静置6 min，再加入20.0 mL 5％的NaOH溶液，用水定容，混匀显色15 min，最后使用1 cm比色皿于510 nm处测定溶液的吸光值，以芦丁标准曲线作为参照，计算核桃青皮总黄酮含量，并按如式（1）求出总黄酮的提取率。
式（1）中：为浸取液中总黄酮质量浓度（mg/mL）；
为浸取液体积（mL）；
为浸取液稀释倍数；
为称取的核桃青皮粉末的质量（g）；
为总黄酮提取率（％）。
1.2.4 单因素实验设计
（1）复合酶配比对总黄酮提取率的影响
在浸取温度为50 ℃，浸取时间为50 min，料液比（g/mL）为1∶30，浸取液pH为5.0，复合酶配比（果胶酶/纤维素酶）分别为0∶0、1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1的条件下，考察复合酶配比（果胶酶/纤维素酶）对总黄酮提取率的影响。
（2）浸取温度对总黄酮提取率的影响
在复合酶配比（果胶酶/纤维素酶）为1∶1，浸取时间为50 min，料液比（g/mL）为1∶30，浸取液pH为5.0，浸取温度分别为35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃的条件下，考察浸取温度对总黄酮提取率的影响。
（3）浸取时间对总黄酮提取率的影响
在复合酶配比（果胶酶/纤维素酶）为1∶1，浸取温度为50 ℃，料液比（g/mL）为1∶30，浸取液pH为5.0，浸取时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min的条件下，考察浸取时间对总黄酮提取率的影响。
（4）料液比对总黄酮提取率的影响
在复合酶配比（果胶酶/纤维素酶）为1∶1，浸取温度为50 ℃，浸取液pH为5.0，浸取时间为50 min，料液比（g/mL）分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的条件下，考察料液比（g/mL）对总黄酮提取率的影响。
（5）浸取液pH对总黄酮提取率的影响
在复合酶配比（果胶酶/纤维素酶）为1∶1，浸取温度为50 ℃，料液比（g/mL）为1∶30，浸取时间为50 min，浸取液pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的条件下，考察浸取液pH对总黄酮提取率的影响。
2.1 芦丁标准曲线
如图1所示，以吸光度为因变量，芦丁质量浓度（mg/mL）为自变量，得到线性回归方程为=11.589－7×10-6，相关系数2=1，芦丁标准曲线线性关系良好。
图1 芦丁标准曲线
2.2 单因素实验结果
2.2.1 复合酶配比的影响结果
不同复合酶配比下的总黄酮提取率如图2所示，可知在其他条件不变时，加入复合酶后核桃青皮总黄酮提取率显著提高，说明加入复合酶有助于总黄酮的溶出。其中，当复合酶配比（果胶酶/纤维素酶）为1∶1时，总黄酮提取率达到最大，这可能与核桃青皮的细胞壁组成和纤维素酶、果胶酶的酶活力不同有关。
图2 不同复合酶配比下的核桃青皮总黄酮提取率
2.2.2 浸取温度的影响结果
不同浸取温度下的核桃青皮总黄酮提取率如图3所示，可知在其他条件一定时，总黄酮提取率随着浸取温度的升高呈现先升后降的趋势，在55 ℃时达到峰值。原因可能是，随着温度的升高，复合酶的活性逐渐增强，在55 ℃时活性最强，而当温度超过55 ℃后复合酶逐渐失活，导致总黄酮提取率降低[11-12]。
图3 不同浸取温度下的核桃青皮总黄酮提取率
2.2.3 浸取时间的影响结果
不同浸取时间下的核桃青皮总黄酮提取率如图4所示，可知在其他条件一定时，总黄酮提取率随浸取时间的增加整体呈先升后降的趋势，当浸取时间为30 min时，总黄酮提取率达到最大值。原因可能是，随着时间的延长，超声波的空化、振荡作用和复合酶的破壁作用结合，不仅使核桃青皮组织细胞破碎程度增加，也使黄酮类物质的损失增加，从而降低了总黄酮的提取率。
图4 不同浸取时间下的核桃青皮总黄酮提取率
2.2.4 料液比的影响结果
不同料液比下的核桃青皮总黄酮提取率如图5所示，可知在其他条件一定时，核桃青皮总黄酮的提取率随液料比（g/mL）的增加呈先升后降的趋势，在液料比（g/mL）为1∶35时达到最大值。可能原因是，浸取液较少时，核桃青皮粉末与浸取液的接触面有限，总黄酮溶出效果欠佳。随着溶剂量的增加，核桃青皮粉末与浸取液的接触面积增大，浸取更充分，进而核桃青皮总黄酮溶出率升高。当料液比（g/mL）超过1∶35，继续增加浸取液的量对总黄酮的溶出发挥作用开始受限，而与黄酮类物质存在拮抗作用的色素等其他杂质的溶出率开始上升，反而影响了总黄酮的提取效果[13]。
图5 不同料液比下的核桃青皮总黄酮提取率
2.2.5 浸取液pH的影响结果
不同浸取液pH下的核桃青皮总黄酮提取率如图6所示，可知在其他条件一定时，浸取液pH对总黄酮提取率的影响波动较大，其中在pH=6.0时，总黄酮提取率达到最大值。其主要原因是，复合酶由果胶酶和纤维素酶两种酶组成，而这两种酶的最适pH不一致，所以在不同的pH条件下各自发挥的作用存在差异。当pH=6.0时，两种酶的协同作用最强。当pH超过6.0时，复合酶开始出现失活，致使总黄酮提取率开始下降。
图6 不同浸取液pH下的核桃青皮总黄酮提取率
3.1 响应面法实验因素设计
根据单因素实验结果，选取对核桃青皮总黄酮提取率影响较大的三个因素为自变量，即浸取温度、浸取时间、浸取液pH，以核桃青皮总黄酮提取率为因变量，进行三因素三水平Box-Behnken响应面法实验设计，如表1所示。
表1 响应面实验因素水平和编码
3.2 响应面实验结果及分析
3.2.1 响应面实验分组设计及结果
浸取温度、浸取时间、浸取液pH的三因素三水平Box-Behnken响应面法分析实验设计及提取率结果如表2所示。
表2 响应面实验分组设计与结果
3.2.2 建立响应面模型拟合及方差分析
以浸取温度、浸取时间、浸取液pH为考察因素，以总黄酮提取率为评价指标，使用Design-Expert10.0.1软件对实验数据进行统计分析，得到二次多项式回归方程如下：
=7.498+0.0425-0.055-0.0425+0.0525+0.0375+0.0575-0.595252-0.520252-0.585252（2）
对回归方程进行方差分析，结果如表3所示。浸取温度、浸取时间、浸取液pH三个因素对总黄酮提取率影响均显著，其中浸取时间对总黄酮提取率影响最显著。该模型＜0.000 1，说明此模型差异具有统计学意义，而且实验模型与真实数据拟合程度良好，可用于分析和预测核桃青皮总黄酮提取率最优提取工艺。
表3 响应面拟合回归方程的方差分析结果
续表3响应面拟合回归方程的方差分析结果
注：2=0.996 7，Adj2=0.992 4，Pred2=0.965 4。
3.2.3 响应曲面分析
不同因素间的交互作用对总黄酮提取率的影响见图7至图9。
由图7可见，浸取温度和浸取时间交互作用下的总黄酮提取率呈抛物面分布，当浸取温度不变时，总黄酮提取率随浸取时间的延长呈先升后降趋势；
当浸取时间一定时，总黄酮提取率随浸取温度的升高也呈先升后降趋势；
由曲面波动幅度可见浸取时间较浸取温度对总黄酮提取率的影响更为显著。可得到两因素的最优工艺组合在浸取温度54 ℃～57 ℃、浸取时间28 min～32 min。
由图8可见，浸取液pH和浸取温度的交互作用等高线呈近圆形，表明二者的交互作用对总黄酮提取率影响不显著。总黄酮提取率随浸取液pH和浸取温度的增加呈现先增后减变化，当浸取温度为54 ℃～57 ℃，浸取液pH取5.9～6.1水平区间值时，总黄酮提取率最高。
由图9可见，浸取时间与浸取液pH交互作用曲面图纵向跨度较大，值小于0.05，表明二者交互作用对总黄酮提取率影响显著。当浸取时间在28 min～32 min水平区间，浸取液pH在5.9～6.1时，总黄酮提取率最高。
图7 浸取温度和浸取时间的交互作用对总黄酮提取率的影响
图8 浸取温度和浸取液pH的交互作用对总黄酮提取率的影响
最后，综合回归方程的方差分析结果和响应曲面分析结果，采用Design-Expert 10.0.1软件进行分析，得到超声波辅助复合酶法提取核桃青皮总黄酮的最优工艺：浸取温度为55.16 ℃，浸取时间为29.465 min，浸取液pH为5.981，预测总黄酮提取率为7.501％。
3.3 验证实验结果
根据软件预测结果，考虑到操作的可行性，最后确定的最优工艺参数如下：浸取温度为55 ℃，浸取时间为30 min，浸取液pH为6。在此工艺条件下进行三组平行实验，得到总黄酮提取率平均值为7.53％，与预测值7.501％接近，表明响应面法优化超声波辅助复合酶法提取核桃青皮总黄酮工艺的方法有效可行。
本文通过单因素实验和响应曲面分析法确定了超声波辅助复合酶法提取核桃青皮总黄酮的最优工艺，工艺参数分别为复合酶配比（果胶酶/纤维素酶）为1∶1，浸取温度为55 ℃，液料比（g/mL）为1∶35，浸取时间为30 min，浸取pH为6。该工艺条件下三组平行实验的总黄酮提取率平均值为7.53％。
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Study on the Extraction of Total Flavonoids from Walnut Green Husk by Ultrasonic-assisted Compound Enzyme Method
Zhang RunhongXie JianjunZhao Li
（Lanzhou Petrochemical University of Vocational Technology, Lanzhou, Gansu, 730000）
In order to find an optimal technology of extracting total flavonoids from walnut green husk efficiently with water as solvent, so as to return walnut green husk compost to farmland and forest, the extraction of total flavonoids from walnut green husk by ultrasonic-assisted compound enzyme method was studied in this experiment. Firstly, the influence of factors such as compound enzyme ratio, extraction temperature, material liquid ratio, extraction time and pH of extraction solution on the extraction rate of total flavonoids from walnut green husk was analyzed by single factor experiment. Then, the extraction process conditions were optimized by response surface analysis. Finally, the optimization results were verified by three groups of parallel experiments. The results showed that in the ultrasonic environment with power of 100 W, when the ratio of compound enzyme (pectinase/cellulase) was 1:1, the extraction temperature was 55 ℃, the ratio of liquid to material (g/mL) was 1:35, the extraction time was 30 min, and the pH of the extraction solution was 6, the extraction rate of total flavonoids was the highest, about 7.53%.
Walnut Green Husk;Ultrasonic; Compound Enzyme; Total Flavonoids; Extraction Process
10.3969/j.issn.2095-1205.2022.10.15
TQ914
A
2095-1205(2022)10-49-06
兰州石化职业技术大学2021年度教科研项目（KJ2021- 12）
张润红（1987- ），女，甘肃庆城人，本科，讲师，研究方向为化工教学与天然药物有效成分分离。
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