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陈筱冉， 张铭笑， 严建萍， 刘燕蓉， 张万军
(中国农业大学草业科学与技术学院， 北京 100193)
紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上种植面积最大的豆科牧草[1]，被广泛用作饲草、蔬菜和绿肥作物[2]，因营养价值高、适口性好等优点，被誉为“饲料皇后”[3]，是我国广泛栽培的优良牧草[4]。紫花苜蓿的栽培历史悠久，全球栽培面积约达3 000万公顷[5-7]。我国苜蓿主要分布在黄河流域及以北的广大地区[8-9]。随着气候变化、生态及环境问题严重、浇灌水质的下降，苜蓿产区(如内蒙古半干旱、干旱地区)土壤盐渍化程度不断加剧，已严重制约了苜蓿草产业的发展[5,10]。盐胁迫下，紫花苜蓿的产量和品质显著降低，并且其根瘤的形成及固氮能力受到严重影响，造成农牧民经济损失[7,11-12]。因此，提高紫花苜蓿耐盐性对我国草牧业可持续发展具有重要意义。
紫花苜蓿是四倍体、异花授粉植物，具有复杂的遗传背景，应用传统育种手段周期长、难度大。应用基因工程手段对紫花苜蓿耐盐性进行遗传改良是一条理想的途径。近年来，随着基因组数据的发表，研究者通过全基因组关联分析(Genome wide association study，GWAS)、转录组学等方法大大加快了紫花苜蓿内源耐盐基因的筛选。但是，紫花苜蓿遗传转化效率低、周期长，对耐盐基因的功能鉴定进展仍然十分缓慢。发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)属于根瘤菌科(Rhizobitaceae)农杆菌属(Agrobacterium)，为革兰氏阴性土壤细菌，其携带的Ri质粒能侵染绝大多数双子叶植物，诱发植物受伤部位长出不定根，并将Ri质粒中携带的基因转移到被感染植株的基因组中。该不定根能迅速生长，并产生多个分枝，呈毛发状，称为毛状根(Hairy-root)。毛状根具有生长速度快，次生代谢产物量高且稳定，不需要添加外源植物激素，易获得再生植株等优点，在遗传改良、基因功能研究、次生代谢产品获得等方面具有重要应用[13]。赵恩华等人建立了苜蓿‘WL-525HQ’材料的毛状根转化体系，并对耐铝基因MsLEA2进行了研究，证明了毛状根转化体系可以应用于苜蓿功能基因快速鉴定中[2]。目前，应用紫花苜蓿毛状根体系鉴定耐盐基因功能的研究尚未见报道。
类胡萝卜素作为植物抗氧化系统中非酶类抗氧化剂，在植物抗逆性中起着重要作用。类胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase,CCD)家族成员催化类胡萝卜素裂解生成脱辅基类胡萝卜素[14]，参与植物生长发育及胁迫应答[15]。目前根据拟南芥基因家族分类方法[16]将CCD基因家族分为类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)和9-顺式环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)两大亚族[17]。NCEDs的过表达导致内源脱落酸(Abscisic acid，ABA)的积累[18-19]，CCD亚家族的成员参与了类胡萝卜素风味、香气挥发物和独脚金内酯(Strigolactone，SL)的合成。研究发现，植物CCD4积极参与干旱、ABA等胁迫应答[15,20]。在拟南芥中发现，过表达CsCCD4b增强了拟南芥对盐、脱水和氧化胁迫的耐受性，植物中CCD4酶解产物β-紫罗兰酮显著增加，增强了植株内活性氧代谢酶活性和表达[20]。
实验室前期研究发现在紫花苜蓿盐胁迫转录组数据中MS.gene073883基因表达量显著增高，通过NCBI比对发现其为MsCCD4基因。为阐明该基因在调控苜蓿耐盐性中的功能，本研究通过紫花苜蓿发根体系，将响应盐胁迫的MsCCD4导入紫花苜蓿叶片诱导获得转基因毛状根，验证了过表达MsCCD4对紫花苜蓿耐盐性的影响。
1.1 试验材料
以紫花苜蓿‘中苜1号’植株成熟叶片为试验材料。
1.2 试验方法
1.2.1基因克隆及生物信息学分析 本研究以‘中苜1号’紫花苜蓿cDNA为模板，依据MS.gene073883基因序列设计引物(MsCCD4_F：ATGATCCCAAA ACCCATCATAATAACAAG和MsCCD4_R：CT ACGACACCGACAACTTGGTGATGTCAC)，PCR扩增MsCCD4基因CDS序列。利用ExPASy(SIB Swiss Institute of Bioinformatics，https://www.expasy.org/)网站中的ProParam(https://web.expasy.org/protparam/)工具对MsCCD4蛋白进行理化性质以及一级结构中亲水性/疏水性的分析。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在线软件进行MsCCD4蛋白二级结构的分析。分别采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在线软件和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线软件进行同源建模和保守结构域预测。
1.2.2盐胁迫响应分析 选取生长4周的‘中苜1号’扦插苗，应用1/4霍格兰营养液添加0 mmol·L-1或200 mmol·L-1NaCl液体培养，在处理0，1，3，6，12 h时取从上往下第一茎节叶片为样品，进行RNA提取。取1 μg RNA进行反转录合成第一链cDNA(RR047，Takara)。以cDNA为模板，应用Starlighter SYBR Green qpcr Mix (北京启衡星生物科技有限公司，FS-Q1002)试剂，qTOWER3G(analytik jena)仪器进行表达量检测。利用2-ΔΔCT方法[21]计算MsCCD4基因的表达量。每个处理3个生物学重复，应用SAS 9.0软件进行统计分析。
1.2.3载体构建及农杆菌转化 将MsCCD4基因CDS序列组装至pcGW载体Xba1和BamH1酶切位点之间，受35S启动子驱动，潮霉素基因作为筛选标记基因。
侵染液制备：利用冻融法将pcGW-MsCCD4质粒导入发根农杆菌LBA9402中。将含有目的基因的发根农杆菌用YEB培养基(NaCl 10 g·L-1+酵母提取物5 g·L-1+胰蛋白胨10 g·L-1+琼脂15 g·L-1)摇培至OD6000.8左右。菌液3 000 r·min-1离心10 min，用重悬液(MS 2.95 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+乙酰丁香酮100 μmol·L-1，pH 5.4)重悬菌液至OD600至0.5，28℃放置30 min，备用。
外植体浸染及共培养：选取‘中苜1号’紫花苜蓿植株叶片作为外植体，50%次氯酸钠溶液震荡漂洗5 min左右，无菌水冲洗5～10次。将无菌叶片浸泡于重悬液中，负压浸染10 min。然后80 r·min-1摇培浸染20 min，弃菌液，将侵染后的叶片置于无菌滤纸上，吸干表面菌液。将叶片置于含有一层滤纸的共培养基上(MS 2.95 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂8 g·L-1+乙酰丁香酮100 μmol·L-1，pH 5.8)，(25 ± 1)℃下暗培养3 d。
除菌培养：将共培养后的材料置于除菌培养基(MS 2.95 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂8 g·L-1+头孢噻腭钠(Cef)500 mg·L-1+潮霉素5 mg·L-1，pH 5.8)。黑暗条件下25℃恒温培养。每隔2周换一次培养基。待根长到1.5 cm以上时，将毛状根从叶片上分离，转移入新的除菌培养基，每2周换一次培养基。
1.2.4转基因毛状根鉴定 挑选生长迅速的毛状根进行培养，采用CTAB法抽取总DNA进行PCR鉴定。PCR引物为：35s_F—CGCACAATCCCACTATCCTTC，MsCCD4_R—CTACGACACCGACAACTTGGTGATGTCAC。应用Trizol试剂提取毛状根RNA，依据上述方法进行反转录与表达量检测。qRT-PCR引物为:MsCCD-qRT-F—CCTCG TGACCACCCTGACCTAC，MsCCD-qRT-R—TT-G CCGTCGTCCTTGAAGAAGATG。
1.2.5毛状根耐盐性检测 将相同长度的PCR阳性毛状根及对照毛状根根段分别转接至含有0 mM、30 mM和50 mM NaCl的固体培养基上。培养2周后，观察毛状根的色泽及生长状况。耐盐性筛选培养基：MS培养基2.95 g· L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂8 g·L-1+ NaCl 0 mmol·L-1/30 mmol·L-1/50 mmol·L-1。
2.1 紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及生物信息学分析
2.1.1紫花苜蓿MsCCD4基因全长序列及蛋白理化性质 克隆获得紫花苜蓿MsCCD4基因全长CDS序列(C-1，图1)，全长1 745 bp，编码一个分子式为C2880H4506N750O856S18、相对分子量为63 911.05 kDa、原子数为9 010、氨基酸残基数为581、理论等电点为6.34的氨基酸序列(图1)。根据其氨基酸组成(表1)可知，该氨基酸序列中含有碱性氨基酸(K，R)59个；
酸性氨基酸(D，E，H)75个，其中Pro(51个，8.8%)，Ile(46个，7.9%)和Gly(45个，7.7%)相对含量比较多；
正电荷残基总数(Asp + Glu)为63，负电荷残基总数(Arg + Lys)为59；
亲水性平均数为—0.270，蛋白质三级结构不稳定系数(Ⅱ)为35.31，表现为稳定状态，由此推断MsCCD4可能为稳定的酸性蛋白质。
图1 紫花苜蓿MsCCD4氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of MsCCD4注：C-1，克隆获得的MsCCD4氨基酸序列；
CCD，MS.gene073883基因氨基酸序列；
横线标注区域为RPE65保守结构域Note:C-1,the amino acid sequence of MsCCD4 obtained by cloning;CCD,amino acid sequence encoded by MS.gene073883;The labeled region is RPE65 conserved domain
表1 紫花苜蓿MsCCD4氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of MsCCD4
2.1.2紫花苜蓿MsCCD4蛋白结构预测 对紫花苜蓿MsCCD4蛋白一级结构进行预测，发现其主要为亲水蛋白(图2A)，二级结构中主要由α螺旋、β折叠以及无规则卷曲构成(图2B)，其中以无规则卷曲为主，占54.91%；
其次是α螺旋占15.66%；
β折叠含量最少，仅占5.16%(图2C)。MsCCD4蛋白C-端含有RPE65保守结构域(图1，图2D)。同源建模发现模板蛋白的可信度及其与目标蛋白的匹配度均较高(图2E)。
图2 紫花苜蓿MsCCD4蛋白结构预测Fig.2 Predicted structure for MsCCD4 protein注：A，紫花苜蓿MsCCD4蛋白亲水性分析；
B，紫花苜蓿MsCCD4蛋白的二级结构；
C，紫花苜蓿MsCCD4蛋白二级结构的组成；
D，紫花苜蓿MsCCD4蛋白保守结构域预测；
E，紫花苜蓿MsCCD4蛋白三级结构同源建模Note:A,hydrophilic analysis of alfalfa MsCCD4 protein;B,secondary structure of alfalfa MsCCD4 protein;C,composition of secondary structure of alfalfa MsCCD4 protein;D,prediction of conservative domain of alfalfa MsCCD4 protein;E,homology modeling of alfalfa MsCCD4 protein tertiary structure
2.2 盐胁迫下紫花苜蓿MsCCD4表达模式分析
在新疆大叶基因组数据中获取MS.gene073883基因上游2 000 bp序列，利用plantCARE对紫花苜蓿MsCCD4基因启动子元件进行分析(表2)。发现启动子区含有11个顺式反应响应元件，包含多个光响应元件如ATC-motif，G-box，Box4等；
多种激素响应元件如茉莉酸响应元件CGTCA-motif、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element；
含有逆境胁迫响应元件如MBS，LTR以及ABRE等。
表2 紫花苜蓿MsCCD4基因启动子元件分析Table 2 Gene promoter element analysis of MsCCD4
正常培养条件下，紫花苜蓿MsCCD4基因在0 h～6 h表达量逐渐上升，6 h～12 h表达量显著下降，表明其响应光周期变化。200 mmol·L-1NaCl处理后，MsCCD4在1 h和3 h的表达量显著高于对照，6 h和12 h的表达量显著低于对照。以上数据表明，光周期变化及盐胁迫显著影响MsCCD4基因的表达(图3)。
2.3 紫花苜蓿MsCCD4基因耐盐胁迫性能分析
2.3.1过表达MsCCD4紫花苜蓿毛状根的获得 构建过表达MsCCD4的植物表达载体pcGW-MsCCD4(图4A)，将其导入发根农杆菌并侵染紫花苜蓿(图4B)，侵染后的叶片置于除菌培养基中培养2周后，叶片表面长出毛状根(图4C)。将生长到1.5 cm以上的毛状根与叶片分离，置于新鲜的培养基中培养(图4D)。挑选生长迅速的毛状根进行培养(图4E)，采用CTAB法抽取总DNA，进行PCR鉴定。PCR检测结果表明检测的10个毛状根中8个为转基因毛状根：CCD-1，CCD-2，CCD-4，CCD-5，CCD-6，CCD-7，CCD-9以及CCD-10(图4F)。定量PCR结果显示，转基因阳性毛状根中MsCCD4的表达量显著高于对照材料(图4G)。
图3 紫花苜蓿MsCCD4基因盐胁迫响应分析Fig.3 Salt stress response analysis of MsCCD4注：CK，未进行盐处理的紫花苜蓿对照组；
NaCl，经过200 mmol·L-1 NaCl处理的实验组；
*代表不同处理间差异显著，P<0.05Note:CK,Alfalfa control group without salt treatment;NaCl,The experimental group was treated with 200 mmol·L-1 NaCl;* represents significant difference between different treatment at the 0.05 level
图4 过表达MsCCD4转基因毛状根获得及鉴定Fig.4 Acquisition and identification of transgenic hairy roots overexpressing MsCCD4注：A，pcGW-MsCCD4载体T-DNA示意图；
B，侵染后叶片共培养；
C，侵染后的叶片再生出毛状根；
D，毛状根除菌培养；
E，生长旺盛的毛状根；
F，转基因毛状根PCR鉴定；
M，Marker；
N，空白对照；
P，PCR模板为质粒；
1～10为过表达MsCCD4转基因毛状根；
E1，E2,E3，pcGW载体转化毛状根；
G，转基因毛状根中MsCCD4表达量检测；
WT，野生型毛状根；
CCD-1，CCD-5，CCD-7，CCD-10为过表达MsCCD4毛状根；
*代表与WT相比差异显著，P<0.05Note：A,schematic diagram of pcGW-MsCCD4 vector T-DNA;B,co-culture of infected leaves;C,the regeneration of leaf hairy root;D,culture of hairy rhizometry;E,vigorously growing hairy roots;F,PCR identification of transgenic hairy roots;M,Marker;N,blank control;P,the PCR template is a plasmid;1～10,overexpressed MsCCD4 transgenic hairy roots;E1,E2,E3,pcGW vector transgenic hairy roots;G,the relative expression level of MsCCD4 in WT and transgenic hairy roots;WT,wild-type hairy root;CCD-1,CCD-5,CCD-7,CCD-10,overexpression MsCCD4 transgenic hairy roots;* represents significant difference compared to WT at the 0.05 level
2.3.2转基因毛状根耐盐性检测 将相同长度的转基因阳性毛状根(CCD-1、CCD-5和CCD-7)及WT毛状根片段分别转接至含有0 mmol·L-1，30 mmol·L-1和50 mmol·L-1NaCl的固体培养基上(图5)。培养2周后统计显著生长的毛状根数量。结果表明，在0 mmol·L-1和30 mmol·L-1NaCl培养条件下，MsCCD4转基因毛状根与野生型相比，毛状根生根数量无显著差异(图5，6)；
在50 mmol·L-1NaCl培养条件下，MsCCD4转基因的毛状根有明显生长的根数显著多于WT(图6)。并且统计分析发现，WT毛状根的生长显著受盐胁迫抑制；
MsCCD4转基因的毛状根CCD-1和CCD-7的生长不受盐影响，并且CCD-5在盐胁迫下的生长显著优于对照组。以上研究表明，过表达紫花苜蓿MsCCD4毛状根的耐盐性显著提高。
图5 紫花苜蓿毛状根耐盐性检验Fig.5 Salt tolerance test of alfalfa hairy roots
图6 盐胁迫下野生型和转基因显著生长的毛状根数量Fig.6 Number of hairy roots of wild-type and transgenic plants growing significantly under salt stress注：*代表与WT相比差异显著(P<0.05)Note:* represents that the number of hair roots varies significantly compared to WT at the 0.05 level
发根农杆菌诱导的毛状根在作物基因功能研究、次生代谢物获得等方面应用广泛。应用发根农杆菌诱导紫花苜蓿外植体产生毛状根，鉴定耐盐基因功能的研究报道较少[22]。本试验利用紫花苜蓿‘中苜1号’离体叶片为外植体，通过发根农杆菌诱导产生毛状根，验证了MsCCD4基因的耐盐功能。本研究为苜蓿耐盐遗传改良提供了新的基因资源，也为苜蓿耐盐基因的功能快速鉴定提供了一种有效方法。
根是植株感知盐胁迫和吸收钠离子的重要植物器官，盐胁迫抑制根的伸长。因此，可通过观察毛状根在盐胁迫下的生长反应，验证基因在紫花苜蓿中的盐胁迫功能。紫花苜蓿毛状根体系具有转化效率高、周期短等优点，是鉴定苜蓿耐盐基因的理想体系。赵恩华等人研究发现以紫花苜蓿‘WL-525HQ’叶片为外植体，LBA9402菌液浓度为OD600=0.5、潮霉素浓度为5 mg·L-1时，转化效率达到最高[2]。本研究应用同样条件侵染‘中苜1号’材料，毛状根转化效率可达80%。表明，LBA9402对不同苜蓿品种都具有较高的侵染能力。
类胡萝卜素可在所有光合植物和一些非光合微生物中合成[23]。类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD是一种催化各种类胡萝卜素转化为较小的类胡萝卜素的重要酶，对类胡萝卜素风味、香气挥发物和植物激素ABA/SLs的合成以及对非生物胁迫的响应至关重要。CCD4基因属于CCD家族中类胡萝卜素裂解双加氧酶亚族，其参与C40-类胡萝卜素和C27-类胡萝卜素中9,10双键的裂解，这在形成花和果实[24-25]的颜色、风味和香气特性方面具有重要作用。在多种植物如大豆、烟草等中，CCD4基因积极参与干旱、ABA等胁迫应答，其裂解类胡萝卜素产生的β-紫罗兰酮和β-环柠檬醛等去异戊二烯，在许多植物中作为胁迫信号分子在高光胁迫下发挥作用[15,23]。我们前期在紫花苜蓿转录组数据中发现，盐胁迫显著诱导MsCCD4表达。本研究中经过定量检测进一步证明其响应盐胁迫，这可能与其启动子区含有多个胁迫响应及激素响应元件有关。然而，CCD4基因的在紫花苜蓿中是否参与抗盐机制尚不清楚。有报道显示，在拟南芥中过表达响应盐和脱水胁迫的番红花CsCCD4b[26]基因，增强了拟南芥对盐、脱水和氧化胁迫的耐受性[20]。转基因植株中CCD4酶解产物β-紫罗兰酮显著增加，增强了植株内活性氧代谢酶活性和表达[20]。然而，不同物种中CCD4的功能具有一定的特异性。拟南芥AtCCD4可以将8′-apo-β-胡萝卜素-8′-al分解为β-紫罗兰酮，而苹果MdCCD4和菊花CmCCD4几乎不降解该底物。CmCCD4a和MdCCD4能很好地切割β-胡萝卜素，生成β-紫罗兰酮，而OfCCD4、RdCCD4和AtCCD4对该底物几乎无活性[27]。本研究中克隆了紫花苜蓿的MsCCD4基因，生物信息学分析表明紫花苜蓿MsCCD4蛋白为酸性的亲水性蛋白质，C-端含有RPE65保守结构域。这与烟草中NtCCD4的蛋白结构相似[28]。应用发根农杆菌LBA9402菌株诱导转化，我们获得MsCCD4转基因阳性的紫花苜蓿毛状根。在50 mmol·L-1盐胁迫的条件下，MsCCD4基因的紫花苜蓿毛状根生长表现显著优于野生型紫花苜蓿毛状根，表明MsCCD4基因提高了苜蓿毛状根的耐盐性，可作为紫花苜蓿耐盐性遗传改良的分子工具，但具体分子调控机制仍需要进一步研究。
本研究克隆到紫花苜蓿响应盐胁迫的MsCCD4基因，通过发根农杆菌菌株LBA9402侵染紫花苜蓿叶片外植体，获得转MsCCD4基因的毛状根。盐胁迫下，过表达MsCCD4毛状根生长表现较好，说明MsCCD4具有耐盐功能，可提高紫花苜蓿耐盐性。本研究为紫花苜蓿耐盐基因鉴定提供了新方法和耐盐基因资源。
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