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娄永庆 陈红跃
甲状腺癌(thyroid cancer, TC)是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤之一,约占每年全世界确诊癌症的3.4%,其中以甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)最为常见,占85% ～90%[1,2]。
本课题组前期研究发现,夏枯草能够有效抑制PTC 细胞的恶性行为,呈现浓度依赖性,然而其具体的分子机制目前尚不清楚[3]。
既往多篇研究报道,long non-coding RNA BANCR 在肺癌和膀胱癌中发挥着抑癌的功能,在黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌中却作为致癌角色存在,而其在PTC 中的表现也相当复杂[4～13]。
目前,夏枯草与BANCR 之间的研究报道较少,因此,本研究通过体外培养B-CPAP 细胞实验,探究夏枯草通过BANCR 对B-CPAP 细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其具体的作用机制,为夏枯草应用于PTC 的防治提供一定的理论根据。
1.实验细胞株：人甲状腺乳头状癌细胞株(B-CPAP)购自中国上海iCell Bioscience 公司;正常人甲状腺细胞株(Nthy-ori 3-1)购自北纳(北京)生物技术研究院。
2.实验药物：夏枯草配方颗粒购自四川新绿药业有限公司,批号：1809025,规格为5 克/盒,每克颗粒相当于生药夏枯草8g。
顺铂,货号：HY-17394,购自中国上海百舜生物科技有限公司,规格是100 毫克/瓶,纯度大于99%。
3.实验主要试剂与设备：胎牛血清、RPMI-1640、PBS、0.25%胰蛋白酶购自以色列Biological Industries 公司;青链霉素双抗混合液、高效RIPA 裂解液、DMSO、PMSF 蛋白酶抑制剂、ECL 超敏化学发光检测试剂盒、NC 膜购自中国北京索莱宝公司;CCK-8 试剂盒购自中国上海同仁化学科技公司;BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自中国上海碧云天生物技术公司;蛋白电泳凝胶制备试剂盒购自中国西安晶彩生物技术有限公司);MMP2、MMP9、GAPDH 抗体、兔抗购自中国-武汉三鹰科技科技有限公司;lncRNA BNACR抑制剂、negative control、lncRNA BNACR RT 引物、lncRNA BNACRqPCR 引物、GAPDH 引物购自中国上海生工生物工程股份有限公司;RNA 快速提取试剂盒购自北京金百特生物科技有限公司;mRNA 反转录试剂盒、mRNA 扩增试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司;Transwell 细胞共培养小室购自美国Corning 公司;超净工作台(JB-CJ-2FC 型)购自中国苏州冯氏实验动物设备有限公司;柜式恒温培养箱(HZ150L 型)购自中国武汉瑞华仪器设备有限责任公司;超速低温离心机(SIGMA3-K 型)购自美国Sigma-Aldrich 公司;全波长扫描式多功能读数仪(Varioskan Flash 型)购自美国Thermo Fisher Scientific 公司;日立超速离心机(HITACHⅠ型)购自中国上海妙生科贸有限公司;蛋白凝胶成像系统(XBCX-S-044 型)购自中国上海艾研生物科技有限公司等。
4.siRNA 的引物合成和qRT-PCR 干扰BANCR：lncRNA BANCR 的有效干扰序列上游引物：5"-CCACAUAUCAGCUUGGUUUTT-3",下游引物：5"-AAACCAAGCUGAUAUGUGGTT-3";控制序列si-NC 序列上游引物：
5"-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3",下游引物：5"-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3"。
通过实时荧光定量PCR 进行BANCR 的上游引物：5"-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3",下游引物：5"-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3";内部参考GAPDH 上游引物：5"-ATTCCATGGCACCGTCAAGG-3,下游引物：5"-TCGCCCCACTTGATTTTGA-3"。
以上序列由中国上海生工生物工程股份有限公司合成。
5.细胞培养与人甲状腺癌细胞株的转染：使用10%FBS 培养基培养B-CPAP 与Nthy-ori 3-1 细胞,培养瓶置于5%CO2、37℃的恒温培养箱内。
当细胞浓度生长到70% 左右时,按照转染和说明书的指导,将lncRNA BANCR siRNA 和si-NC 分别作用于细胞。
实验分为正常甲状腺细胞(N)组、甲状腺乳头状癌细胞(B0)组、中药夏枯草干预(B1.0)组、阴性对照(Bnc)组、siRNA 干预(Bsi)组、中药夏枯草+siRNA 干预(B1.0 + si)组和顺铂干预的阳性对照(Bs)组。
6.夏枯草溶液的制备：取1g 夏枯草颗粒充分溶解于20ml RPMI-1640 完全培养液中,震荡混匀,置于超声仪器上处理30min,超速离心机2000r/min,离心10min,初步去除沉渣杂质,0.22mm 超微过滤器正压抽滤除菌,制得浓度为40mg/ml 的夏枯草原液,4℃分装保存备用。
7.qRTPCR 技术方法检测lncRNA BANCR 表达水平的变化：转染剂作用48h、夏枯草24h 以后,提取各组细胞所含总RNA,RNA 的纯度及浓度测定后,反转录合成cDNA,储存在-80℃冰箱备用。
GAPDH作为内参,qRT-PCR 检测lncRNA BANCR 的表达含量[20μl 反应体系：2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μl,分别加入0.4μl(10μmol/L)上下游引物,2μl 的cDNA,体积不足20μl 用ddH2O补充]反应条件为：95℃预变性10min,然后95℃15s、60℃1min,共40 个循环。
结果以2-△△CT方法来统计,表示lncRNA BANCR 的表达量。
8.Western blot 法检测MMPs 表达水平的变化：转染剂作用48h、夏枯草24h 以后,提取各组细胞所含总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度,用于后续配置样品,然后用SDS-PAGE 电泳将蛋白转移至NC 膜上,并使用5%脱脂乳密封蛋白质。
然后,将兔抗MMP2、兔抗MMP9(1∶2000 稀释)孵育蛋白条带,并将条带置于4℃冰箱过夜。
洗膜,孵育二抗(兔抗∶5%脱脂乳=1∶2000 稀释),室温摇床上放置1.5h,再次洗膜3 遍,30min 后,ECL 显色,成像仪曝光拍摄。
采用Image J 软件检测各组条带的灰度值,表示MMP2/9的相对表达含量高低。
9.通过CCK-8 法检测甲状腺癌细胞株的增殖：以10000 个/孔的浓度将B-CPAP 细胞接种在96 孔板中,配置每孔体积在100μl,每组需设立5 个副孔。放置37℃恒温箱24h 后,细胞贴壁,甩去板内原液体,PBS 冲洗两遍,并使用siRNA 转染细胞。
48h 后,中药组使用1.0mg/ml 浓度夏枯草溶液,每孔100μl的体积注入。
72h 后,甩去板内的夏枯草溶液,PBS冲洗两遍,然后用移液器每孔打入8μl CCK-8 溶液,剩余用纯培养基补充至100μl,置于培养箱中孵育1 ～6h,打开自动酶标读数仪,波长调整为450nm,记录吸光度(A)值,整理数据。
10.Transwell 实验检测B-CPAP 细胞侵袭能力的变化：将干扰序列和对照组的序列转染到B-CPAP 细胞中,当转染的细胞生长到80% ～90%且状态良好时,用胰蛋白酶将贴壁细胞消化下来,加入2%无链红霉素培养基配置成细胞悬液,显微镜下计数、统计,调整细胞浓度为3 ×105个/毫升,将细胞悬液100μl 加入到Transwell 小板的上室内,依照原先设计的分组缓慢向下层小室加入夏枯草、顺铂溶液各500μl,每组设立3 个复孔,37℃条件下反应24h。
小室底层的细胞用4%组织细胞固定液固定30min,结晶紫染色10 ～20min。
随机选取5 个视野,拍照计数。
11.划痕实验检测B-CPAP 细胞迁移能力的变化：转染剂作用细胞48h 后,在培养板各孔划出6 道“1”字样划痕,PBS 清洗两遍,加入夏枯草(1.0mg/ml)、顺铂(10μg/ml)各2ml,置于ZOOM 显微镜下拍照,每6h 拍摄1 次,48h 后取出。
采用Image J 软件对划痕面积进行分析。
12.统计学方法：应用SPSS 21.0 统计学软件对实验数据进行统计分析,使用GraphPad Prism8.3 作图,组间差异用单因素方差分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,以P＜0.05 为差异有统计学意义。
1.夏枯草对B-CPAP 细胞中lncRNA BANCR 表达的影响：qRT-PCR 实验结果显示,与正常甲状腺细胞比较,B-CPAP 细胞中lncRNA BANCR 高表达,而夏枯草作用于B-CPAP 细胞24h 后,lncRNA BANCR 的表达水平出现了显著降低,各实验组与B0组结果比较,差异有统计学意义(P＜0.05,图1)。
图1 各组细胞lncRNA BANCR 表达水平
2.夏枯草对B-CPAP 细胞中MMP2、MMP9 表达的影响：Western blot 法检测结果显示,B-CPAP 细胞中MMP2、MMP9 高表达,正常甲状腺细胞中低表达(图2)。
夏枯草作用于B-CPAP 细胞24h 及沉默了lncRNA BANCR 后能够明显下调MMP2、MMP9 的表达量,各实验组与B0 组结果比较,差异有统计学意义(P＜0.05,图3)。
图2 夏枯草作用后各组蛋白印迹结果
图3 夏枯草作用后各组相关蛋白表达水平
3.夏枯草对B-CPAP 细胞生存率的影响：B0组、Bnc 组细胞生长状态良好,而在加入了1.0mg/ml 的夏枯草后,B1.0 组细胞存活率显著降低,随后敲低了B-CPAP 中lncRNA BANCR 的表达,其对B-CPAP细胞增殖的抑制效果更为明显。
各实验组与B0 组结果比较,差异有统计学意义(P＜0.05,图4,图5)。
图4 夏枯草对B-CPAP 细胞形态的影响(×200)
图5 夏枯草对B-CPAP 细胞存活率的影响
4.夏枯草对B-CPAP 细胞迁移力的影响：夏枯草作用于B-CPAP 和沉默BANCR 后的细胞株在12、24h,ZOOM 显微镜拍摄到的各组愈合过程的情况(图6)。
实验结果显示,相同时间段内,各实验组较甲状腺乳头状癌细胞(B0)组,划痕愈合率均出现不同程度降低,24h 与12h 比较,差异性更加明显(P＜0.05)。
图6 夏枯草对B-CPAP 细胞迁移力的影响(×200)
5.夏枯草对B-CPAP 细胞侵袭力的影响：Transwell 实验结果显示,加入1.0mg/ml 的夏枯草和转染抑制剂的B-CPAP 细胞透膜量降低了约1/2,两者同时作用效果更加明显,各实验组与甲状腺乳头状癌细胞(B0)组结果比较,差异有统计学意义(P＜0.05,图7)。
图7 光镜下各组细胞透膜数(×200)
近年来,随着甲状腺彩超、细针穿刺活检(FNA)及基因检测技术的迅速发展,早期甲状腺癌的诊断准确率大大提升,过去10 多年间,我国甲状腺癌术后5年生存率从67.5%提高至84.3%,但仍远低于西方欧美国家(98.7%)[14]。然而,随着甲状腺癌发生率的不断增长,因术后复发、转移及并发症所导致的死亡人数也在快速增加[15]。
因此,我们更加迫切希望寻求一味能够有效抑制突变型PTC 细胞增殖、侵袭和转移的药物。
夏枯草作为一味软坚、消肿、散结常用的中药,其在甲状腺疾病的防治方面已有超过千年的历史[16]。
临床治疗结果证实,夏枯草在治疗甲状腺慢性、亚急性炎症、甲状腺肿及甲状腺结节方面效果显著[17,18]。
结合相关临床数据和文献资料来看,夏枯草在甲状腺疾病防治方面具有极高的研究价值。
本实验过程中还发现夏枯草作用于沉默了BANCR 的B-CPAP 细胞后,MMP2、MMP9 表达水平下降及其对B-CPAP 细胞增殖、迁移和侵袭作用的抑制效果更加明显,因此证实夏枯草除了通过BANCR 调节MMP2、MMP9 的表达抑制PTC 细胞的恶性行为外,还可以通过别的途径发挥其抑癌的作用。
综上所述,夏枯草能够有效抑制PTC 细胞的增殖、侵袭和迁移的过程,作用机制可能与通过下调lncRNA BANCR 来减少MMP2、MMP9 的表达相关,本研究为将夏枯草作为新型抗癌中草药在临床中推广奠定了理论基础。
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