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雷传芬，陈 杰，李凤玲，杨李波，杨洪燕，练映秀，步 宏
乳腺导管原位癌(ductal carcinoma in situ, DCIS)是局限于乳腺大导管内或终末导管小叶单位(terminal ductal lobular unit, TDLU)的上皮细胞肿瘤性增生性病变，肿瘤细胞均未突破基膜，是浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma, IDC)的非专性前驱病变。随着乳腺X线技术的推广应用，乳腺DCIS的检出量明显增加，占乳腺癌的15%～20%[1]。单纯DCIS预后较好，乳腺癌患者10年病死率为2.4%～2.9%[2-3]；
如果患者不及时治疗，部分DCIS可进展为IDC，预后较差。手术切除是乳腺DCIS患者标准的治疗方式，根据Van Nuys预后指数(Van Nuys Prognostic Index, VNPI)[4]，DCIS分级与预后相关，决定患者术后是否辅助放疗。
乳腺DCIS存在多种不同的命名分级方法[5-9]，各方法的一致性均不理想。尽管个别深度学习法[10]开始尝试进行乳腺DCIS分级，但需要对大样本进行模型训练及验证，短期内难以实现。而DCIS检出量的增加与病理诊断医师人力不足的矛盾日益明显。本实验旨在分析统一诊断标准和借助计算机定量辅助对乳腺DCIS分级一致性的影响，寻求提高乳腺DCIS诊断一致性和准确性的措施。
1.1 材料收集2015年1月～2021年10月四川大学华西医院病理科存档的453例乳腺DCIS标本，每例选取一张具有代表性的HE切片。使用优纳PRECICE 600数字切片扫描仪在40×倍物镜下扫描成全载玻片图像(whole slide image, WSI)，并转化为TIFF格式文件。
1.2 方法本实验经三位具有5年以上诊断经验的病理医师利用开源ASAP软件分三个阶段对病例进行诊断，相邻两个阶段间隔3周以上，未向诊断医师提供患者的临床资料。第一阶段：三位病理医师遵循自身日常诊断标准对纳入的DCIS病例进行低、中、高核级诊断。第二阶段：开始前，由一名高年资乳腺专科病理医师依据第五版WHO乳腺疾病分类[11]DCIS分级标准对三位病理医师进行培训并展示各级别DCIS的典型图片(图1～3)。随后，三位病理医师再次对纳入病例进行诊断。第三阶段：三位病理医师在计算机定量辅助下对DCIS进行分级。首先由一名未参加上述实验环节诊断工作的病理医师在每一张WSI中标注5个DCIS病变区域：若肿瘤异质性大，则各种形态均需被囊括；
若异质性不明显，则随机选取5个病变区域；
若病变总数不足5个导管，则标注该WSI中所有DCIS病变。基于已标注的肿瘤区域，采用腾讯觅影·病理云识别分割标注区域内肿瘤细胞核并测量直径。为更客观地比较肿瘤细胞核相对正常红细胞的大小，在相同流程制片的WSI上测量10个形态较好的红细胞直径，取平均值作为红细胞直径参考值。基于开源ASAP软件嵌入一个展示模块，将标注区域内细胞核直径分布可视化展示，三位病理医师以此作为参考，综合进行诊断(图4)。
图1 低核级乳腺导管原位癌：A.肿瘤筛状构象；
B.肿瘤呈筛状构象，肿瘤细胞较一致；
C.细胞异型性小，个别见核仁 图2 中核级乳腺导管原位癌：A.实体型构象，细胞异型性不明显；
B.细胞轻度异型，伴粉刺样坏死；
C.明显核仁 图3 高核级乳腺导管原位癌：A.坏死常见；
B.细胞异型性明显，伴粉刺样坏死；
C.细胞明显异型性，可见核分裂象
图4 三个阶段诊断流程图：第一阶段：三位医师使用ASAP读片软件进行常规诊断；
第二阶段：经培训交流后，三位医师使用ASAP软件独立进行DCIS分级；
第三阶段：ASAP读片软件嵌入计算机辅助测量肿瘤细胞核大小结果，可视化肿瘤细胞核直径与成熟红细胞直径比值的分布(D肿瘤细胞核/D红细胞核比值<1.5、1.5～2.0、2.0～2.5、>2.5)，医师以此为参考进行DCIS分级
1.3 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，采用Fleiss Kappa值评估医师间诊断的一致性，以P<0.05为差异有统计学意义。Kappa值为0表明一致性极低，Kappa越接近1，提示一致性越好[12]。
2.1 临床资料本组纳入453例DCIS样本，患者年龄20～83岁，平均48.01岁。其中穿刺样本29例(6.40%)，麦默通微创样本46例(10.15%)，切除样本378例(83.44%)(表1)。
表1 453例乳腺导管原位癌患者的临床病理资料
2.2 诊断结果第一阶段诊断：三位医师的诊断意见完全一致者180例(39.74%)，三位医师的诊断意见完全不一致者14例(3.09%)。第二阶段诊断：经培训交流后诊断，三位医师的诊断意见完全一致者186例(41.06%)，完全不一致者6例(1.32%)。第三阶段诊断：经计算机定量辅助，三位医师的诊断意见完全一致者304例(67.11%)，意见完全不一致者0例(图5)。
图5 三位医师分阶段诊断结果：第一至第三阶段诊断中，三位医师诊断意见一致病例逐渐增多，经计算机定量辅助，三位医师诊断意见完全一致病例达304例(67.11%)，意见完全不一致的病例为0
2.3 诊断一致性分析常规诊断阶段，三位医师诊
断DCIS的一致性较低(Kappa=0.360)，差异有统计学意义(P<0.001)，中核级DCIS诊断的一致性较低(Kappa=0.181)，低核级、高核级DCIS诊断一致性高于中级别(Kappa值分别为0.357、0.553)。经培训交流后，三位医师诊断DCIS的一致性略有提升(Kappa=0.362，P<0.001)，中核级DCIS诊断的一致性升高(Kappa值由0.181提升至0.227)，而低、高核级DCIS诊断一致性无明显差异(Kappa值分别为0.348、0.531)。借助计算机定量辅助，三位医师诊断DCIS的一致性明显升高(Kappa=0.638，P<0.001)，相对前两阶段分别提高了0.278、0.276，中核级DCIS诊断的一致性也有提升，Kappa值达0.550，较前两个阶段分别提升0.369、0.323。实验推进过程中，三位医师对中级别DCIS诊断的一致性逐渐提高，三个阶段诊断的Kappa值分别为0.181、0.227、0.550(表2，图6)。
表2 三位病理医师间Kappa值分析
图6 三位医师各阶段诊断Kappa值变化情况
乳腺DCIS分级关系到患者预后评估及决定术后是否需要辅助放疗。目前虽然已有多种不同的DCIS分级方法[5-9]，但由于不同级别肿瘤间缺乏特异性组织学形态，且无特异性免疫标记将不同级别DCIS完全区分。病理分级主要依赖于形态学，实际操作中主观性强，前期相关研究提示医师间诊断的一致性较差[13-15]。本实验主要探讨非乳腺专科病理医师对DCIS分级的一致性及可能的改进措施。结果显示三位医师常规诊断DCIS分级的一致性极低(Kappa=0.360)。即使经过WHO分级标准培训，诊断一致性略有提升。相比于常规诊断，三位医师经培训后诊断中核级DCIS一致性的Kappa值有较为明显改观，但低核级和高核级DCIS诊断一致性并未得到提升，提示统一诊断标准对各位医师已经形成的诊断模式有一定冲击，但是各自对分级标准的把握度不统一，也很难达提高诊断DCIS的整体分级一致性。经计算机定量辅助，三位医师诊断DCIS的一致性明显提高。
影响诊断一致性的因素可以从两方面探讨：主观因素是与医师对诊断标准的把握度相关；
客观因素是诊断标准的可操作性。
经验较丰富的医师对诊断标准的把握度更稳定。如Schuh等[14]召集13位病理医师分别应用Holland、Modifified Lagios和Van Nuys三种分级方法对43例DCIS进行分级，三种分级方法的总Kappa值分别为0.27、0.34和0.37。参与该研究的13位病理医师中包括4位病理医师(低年资医师)和3位乳腺病理专科医师，上述三种分级方法低年资组医师间的诊断一致性(Kappa值分别为0.23、0.29和0.25)低于乳腺病理专科医师诊断的一致性(Kappa值分别为0.38、0.58和0.58)。魏兵等[15]关于导管上皮增生性病变的诊断一致性研究中，同样是高年资组医师的诊断一致性优于低年资组。病理医师经验的积累是一个漫长的过程，DCIS诊断工作也不可能全部由乳腺专科医师完成。本实验第二阶段，三位医师统一接受WHO分级标准培训后，中核级DCIS诊断的一致性略有提升。发现医师B在第一、二阶段诊断中核级DCIS的比例分别为57.84%、58.50%，明显高于医师A和医师C诊断的中核级DCIS比例，甚至高于文献报道的上限(57.6%)[16]；
而医师B诊断低核级DCIS比例为9.27%、10.15%，明显低于医师A和医师C诊断低核级DCIS的比例。说明虽然接受培训，各医师对诊断标准的把握度仍存在差异，医师B对中核级DCIS的诊断较另两位医师宽松，而对低核级DCIS诊断较为严谨苛刻。
医师对诊断标准把握度，也是诊断标准的可操作性的体现。现有分级标准中对核仁、核染色质以及坏死的等级划分相对较主观，甚至有交叉，比如核仁与坏死可以出现在各核级DCIS中；
即使对肿瘤细胞核大小有数值量化，但在实际工作中也难以实现真正量化判断，这些是医师诊断主观性强、一致性差的原因。简化分级标准可以一定程度提高诊断一致性。Alghamd等[17]的一致性研究中，三位病理医师将300例DCIS分为低、中、高核级时Kappa值为0.235，当只作低核级和非低核级两类时Kappa值为0.575，Kappa值高于三种核级的分类。
本实验第三阶段借助计算机定量辅助分析肿瘤细胞核直径与红细胞核直径比值，医师对肿瘤细胞核有更直观准确地评估，三位医师诊断的一致性较高，Kappa值达0.638，低、中、高核级DCIS诊断的一致性较好，Kappa值分别为0.645、0.550和0.749，较前两阶段明显提高。相比已报道的无计算机定量辅助的研究有较好的一致性[18]。
综上所述，DCIS分级一致性影响因素具有多方面性。采用统一诊断标准对提高诊断一致性有一定帮助，医师将诊断标准掌握内化为可以稳定输出的技能需要时间积累。积极寻求客观准确的诊断标准也是有效途径之一。本实验观察计算机定量辅助技术提高DCIS诊断一致性，取得良好效果，如何将更多的分级指标定量化，化主观为客观，成为提高DCIS分级一致性的新思路。
(本实验由河南省肿瘤医院张冰医师和宜春市人民医院张凤医师提供阅片支持；
腾讯AI实验室张军老师和田宽老师在乳腺DCIS肿瘤细胞核分割上提供了技术支持；
四川大学华西医院临床病理研究所石乐飞工程师、赵婷玉工程师和成都理工大学余正波同学开发了计算机定量辅助判读阅片软件，特此致谢！)
