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赵金慧,吴 刚,刘 扬
(内蒙古科技大学包头医学院 基础医学与法医学院,内蒙古包头 014040)
纳米氧化铈(CeO2NPs)是一种稀土氧化物，具有独特的理化性质，作为燃料添加剂[1]、抛光剂[2]、气体传感器[3]等在工业领域被广泛应用的同时，其在医学领域的作用也越来越受到人们重视。CeO2NPs在中性pH条件下带正电荷能够吸附到细菌表面，诱导氧化应激反应，从而对细菌产生毒性作用，具有良好的抗菌能力[4]。此外CeO2NPs在抗癌方面的研究也取得一定进展。研究发现正常细胞与癌细胞的pH值有所差异，而在酸性条件下CeO2NPs可以选择性杀死癌细胞[5]。在酸性环境中，CeO2NPs能够促进胰腺癌细胞自由基生成，并增强癌细胞对放射治疗的敏感性，利于癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长[6]。
CeO2NPs在被广泛应用的同时，其毒性作用也受到重视。研究发现，大鼠经口摄入CeO2NPs 600 mg/kg 28 d，CeO2NPs在肝脏显著累积，并导致门静脉显著扩张[7]，且积累在肝脏的CeO2NPs一般难以清除，能通过诱导氧化应激反应，引发炎症发生[8]。同时CeO2NPs还通过降低肺组织抗氧化物质水平以及促进活性氧产生，诱导肺部炎症反应[9]。在急性肾损伤大鼠模型中，经气管滴注1 mg/kg CeO2NPs后发现，CeO2NPs使大鼠肾组织中肾损伤分子-1(KIM-1)、IL - 6、TNG - α升高更加明显,加重了大鼠急性肾损伤[10]。相比于其他组织，CeO2NPs导致胃肠道损伤研究较少。本研究通过建立CeO2NPs诱导的大鼠肠炎模型，确定CeO2NPs对肠道的毒性作用，以及确定肠炎形成时间，为CeO2NPs的毒理学研究以及安全、合理应用提供实验依据。
1.1试剂与仪器 CeO2NPs(粉末状，粒径<50 nm，纯度99.95 %，货号700290，美国Sigma公司)，4 %多聚甲醛组织固定液(BL539A，中国Biosharp公司)，苏木素-伊红染液(北京索莱宝科技有限公司)；
自动组织脱水机(HistoCore PEARL，德国Leica Biosystems)，石蜡包埋机(HistoCore Arcadia H，德国Leica Biosystems)，切片机(Leica RM2016)；
荧光显微镜成像系统(DM48+DFC450C，德国Leica Biosystems)。
1.2实验动物 24只雄性SD大鼠，体重(125±10)g，购自斯贝福(北京)生物科技有限公司，合格证编号：SCXK(京)2019-0010。大鼠饲养条件：室温保持在20 ℃～25 ℃，相对湿度在40 %～60 %，光暗循环时间为12 h/12 h。实验期间，大鼠可自由饮水和进食。本研究经包头医学院医学伦理委员会批准(2018-016)。
SD雄性大鼠适应性喂养1周后，采取随机数字表法随机分为对照组和模型组,各12只。采用隔天灌胃的方式，对照组给予去离子水，模型组给予CeO2NPs 100 mg/kg。在每给药15 d时随机选取造模组3只大鼠，禁食12 h后，用戊巴比妥钠麻醉、处死。用手术剪沿腹正中线剪开腹腔，将肠道暴露，肉眼观察组织是否有异常后，取空肠、回肠、盲肠、结肠，用4 %多聚甲醛固定48 h。脱水、常规石蜡包埋、切片和HE染色后，在光学显微镜下观察确定肠炎是否形成。
1.3给药浓度计算 实验采用隔天灌胃的方式进行，共计45 d。大鼠灌胃体积为5 mL/kg，根据CeO2NPs灌胃剂量，将CeO2NPs用去离子水配置成浓度为20 mg/kg的混悬液,现用现配。
1.4统计分析 采用SPSS 23.0统计软件进行分析。数值变量采用单因素方差分析法，组间两两比较用LSD法分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1CeO2NPs表征结果 根据高分辨率透射电镜结果所示(图1)，CeO2NPs单个粒子长径<50 nm，外观近似立方体形，CeO2NPs有团聚现象[11]。
图1 CeO2 NPs TEM表征结果:引用同课题组叶倩如文章表征图片
2.2体重结果 如图2所示，对照组和模型组体重增加趋势相同，且对照组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05)，说明CeO2NPs毒性作用小，对体重影响不明显。
2.3大鼠肠道肉眼及病理观察 肉眼观察：与对照组相比，在给药第15 、30 d，模型组大鼠空肠、回肠、盲肠、结肠肉眼观察并无异常，在给药45 d时发现大鼠肠道组织明显变薄。
图2 各组大鼠体重增减趋势结果
病理结果：与对照组相比，造模组大鼠在给药15 d、30 d时空肠、回肠、盲肠、结肠黏膜组织正常，腺体排列整齐，绒毛结构完整，无炎症细胞浸润(图3-6)。与对照组相比，在给药第45 d时大鼠肠道组织出现不同程度炎症反应，提示造模成功(图7-8)。模型中空肠和结肠炎症比较轻微，空肠主要表现为细胞排列疏松，腺体减少、排列紊乱，且在400倍光学显微镜下可观察到炎症刺激的腺体核分裂现象(图9)，结肠有炎症细胞浸润，绒毛破坏脱落，腺体损伤；
回肠和盲肠炎症程度比较重，盲肠有大量炎症细胞浸润，腺体破坏，绒毛变短，黏膜上皮脱落，回肠主要表现为炎症细胞浸润，腺体破坏、排列紊乱。与造模15 d、30 d时相比，45 d病理结果显示各肠道组织黏膜层变薄，绒毛变短。
研究发现，CeO2NPs通过降低体内的抗氧化剂水平使自由基增多，导致机体抗氧化系统紊乱，进而引起氧化应激反应，诱导肝脏、肾脏、肺部组织炎症发生[12-14]。相比于其他组织，CeO2NPs引起胃肠道损伤研究较少。同为纳米材料，纳米银能导致肠道绒毛及腺体损伤，黏膜破环，通透性增加，影响肠道正常功能[15]，纳米铜通过上调促炎细胞因子(IL-8)和抗氧化剂血红素加氧酶1(HMOX1)基因表达，诱导炎症发生[16]。纳米硅通过激活凋亡相关斑点样蛋白(ASC)炎症小体导致肠道炎症恶化[17],经口摄入的纳米二氧化钛能够在肠道积累，导致肠道菌群失调诱导炎症的发生[18]。
图4 模型组15 d各肠道组织病理结果(HE染色，×200)
图5 对照组30 d各肠道组织病理结果(HE染色，×200)
图6 模型组30 d各肠道组织病理结果(HE染色，×200)
图7 对照组45 d各肠道组织病理结果(HE染色，×200)
图8 造模组45 d各肠道组织病理结果(HE染色，×200)
图9 空肠腺体核分裂现象(HE染色，×400)
在本次研究中采用隔天灌胃的方式。大鼠给予100 mg/kg的CeO2NPs 45 d后对大鼠体重影响不明显，但在给药第45 d时肉眼观察大鼠肠组织变薄，病理结果也显示各肠道组织黏膜层变薄，绒毛变短、破坏。Lin等[19]也证实了CeO2NPs能够使斑马鱼肠道微绒毛变钝，使消化作用下降。在本次研究中大鼠肠道表现出不同程度炎症反应，其中空肠和结肠炎症轻微，其次是回肠，盲肠炎症最为严重。研究发现CeO2NPs主要通过粪便和尿液排泄[20]。CeO2NPs通过空肠进入回肠，最后进入盲肠，在结肠形成粪便排出。CeO2NPs在空肠停留时间短，所以对空肠损伤较小。回肠和盲肠相连，CeO2NPs通过回肠进入盲肠。大鼠的盲肠是一个大的盲囊，储存着大量食物残渣[21]，排泄物在盲肠停留时间比较长[22]，包括代谢后的CeO2NPs,所以CeO2NPs对盲肠损伤比较严重。因为回肠和盲肠相连，代谢的CeO2NPs通过回肠进入盲肠，所以回肠炎症反应也比较明显。最后进入结肠的CeO2NPs与其他代谢物形成粪便排出。在结肠CeO2NPs被其他代谢包裹形成粪便，对结肠作用面积小，损伤也较小。
本次研究证明了CeO2NPs确实能够引起大鼠肠道损伤，给药浓度为100 mg/kg时，第45 d大鼠肠道组织出现明显炎症反应，这为CeO2NPs的毒理学研究以及今后在医学领域的安全应用提供实验及理论依据。
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