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焦凤娟,刘俊杰,卢思维,姜东君
（济宁医学院精神卫生学院 山东省行为医学重点实验室，山东 济宁 272067）
转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）是小眼畸形相关转录因子（microphthalmiaassciated transcription factor，MiTF）/转录因子E（transcription factor E，TFE）家族成员之一，属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子。活化的TFEB可通过协同溶酶体表达和调控（coordinated lysosomal expression and regulation，CLEAR）信号网络参与自噬溶酶体基因表达调控，在神经退行性疾病、肿瘤和脂质代谢紊乱等多种疾病的发生发展过程中发挥重要作用［1-5］。TFEB丝氨酸残基的磷酸化状态与其功能活性密切相关［6］。研究［7-11］显示：TFEB多个丝氨酸位点可被多种激酶磷酸化并抑制核转位，降低其活性，将磷酸化位点突变为无法被磷酸化的丙氨酸后可促进TFEB核转位，上调自噬溶酶体等相关基因表达。但相关研究大多集中于动物和细胞水平，体外分析TFEB功能的研究尚不多见。
重 叠 延 伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR）技术是在PCR技术的基础上，利用具有互补末端的引物使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的不断延伸，将不同来源的基因片段拼接起来的一项实验技术［12］。相对于传统基因突变技术，SOE PCR技术不受基因突变位置及突变类型的限制，成功率较高，已成为目前研究蛋白质结构和功能的重要方法［13］。本研究以插入人TFEB基因片段的原核表达质粒pGEX-6p-1-TFEB为模板，将TFEB基因中114位丝氨酸残基突变为无法被磷酸化的丙氨酸，将TFEB及其突变体在大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）中诱导表达，对获得的重组蛋白纯化，为进一步在体外分析TFEB功能提供依据。
1.1 质粒、菌株、主要试剂和仪器pGEX-6p-1-TFEB质粒为济宁医学院精神卫生学院山东省行为医学重点实验室保存。E.coli感受态细胞DH5α和BL21（北京全式金生物技术有限公司）。T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ（美国New England Biolabs公司），2×phahta Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），DNA Marker、质粒DNA提取试剂盒和DNA纯化试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，GS4B谷胱甘肽琼脂糖微珠（美国GE Healthcare公司），氨苄青霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）（美国Sigma公司），考马斯亮蓝R250（上海碧云天生物技术有限公司），其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。PCR仪及电泳装置（美国Bio-Rad公司），紫外分光光度计BioSpec-nano（日本岛津公司），超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。DNA测序由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成。
1.2 定点突变引物设计将TFEB丝氨酸114位点突变为不能被磷酸化的丙氨酸，根据SOE PCR引物设计原理，共设计4条引物，正向引物（F）和反向引物（R）为2条外侧引物，其5′末端分别带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，用于扩增全长TFEB基因片段；
Fn和Rn为突变引物，用于扩增含突变位点的基因片段。引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。引物序列见表1。其中斜体部分表 示BamHⅠ（GGATCC）酶 切 位 点 和SalⅠ（GTCGAC）酶切位点，标下划线的碱基代表突变碱基。
表1 SOE PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of SOE PCR
1.3 SOE PCR技术定点突变目的基因SOE PCR技术定点突变主要通过3步PCR反应完成。以野生型TFEB质粒pGEX-6p-1-TFEB为模板，采用DNA聚合酶对正向引物F和突变引物Rn及反向引物R和突变引物Fn进行第1步PCR扩增，获得含突变位点及其上下游片段产物1和产物2。产物经琼脂糖凝胶电泳分离、DNA纯化试剂盒回收纯化，以产物1和产物2为模板进行第2步变性退火，DNA纯化试剂盒回收纯化。取DNA纯化产物为模板，采用DNA聚合酶对正向和反向外侧引物F和R进行第3步PCR扩增，产物即为引入目的突变位点DNA片段。第1、2和3步PCR扩增循环条件均为95℃预变性30 s；
95℃变性15 s，60.3℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环；
72℃最后延伸5 min。第2步变性退火PCR条件为95℃预变性30 s；
95℃变性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共15个循环；
72℃延伸5 min。见图1。
图1 SOE PCR技术定点突变图Fig.1 Site-directed mutagenesis by SOE PCR technique
1.4 载体pGEX-6p-1-TFEB S114A构建和鉴定突变DNA片段和pGEX-6p-1空载体分别采用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，纯化后的酶切产物采用T4 DNA连接酶于室温连接4～6 h。连接产物经DH5α转化、涂板后，挑取单克隆菌落，37℃、220 r·min－1摇菌过夜，经菌液PCR验证为阳性克隆后，抽提质粒进行双酶切和DNA测序鉴定。
1.5 野生型TFEB及其突变体TFEB S114A体外诱导表达将鉴定正确的重组质粒pGEX-6p-1-TFEB和pGEX-6p-1-TFEB S114A分别转化E.coli感受态细胞BL21，铺至含50 mg·L－1氨苄青霉素LB培养皿上，次日，挑选单克隆菌落，接种至5～10 mL含相应抗生素LB液体培养基中，37℃培养过夜。按照1∶100接种量将过夜培养的菌液接种至10 mL含相应抗生素LB液体培养基中，600 nm波长处吸光度（A）值为0.6～1.0时，加入IPTG至不同终浓度，不同温度下诱导表达过夜，取样SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白表达情况。
1.6 体外诱导表达产物分离纯化收集100 mL诱导表达的菌体，加入10 mL预冷PBS缓冲液，冰浴超声裂解细胞（工作2 s，间隔3 s，功率30%）至澄清透明，12 000 r·min－1、4℃离心15 min，收集菌体和上清。将上清与Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠混合，室温旋转孵育1 h，2 000 r·min－1、4℃离心5 min，弃上清收集琼脂糖珠，采用Elution buffer（10 mmol·L－1还 原 型 谷 胱 甘 肽，50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 8.0）洗脱3次，纯化后产物进行SDS-PAGE分析，检测蛋白浓度和相对分子质量，纯化蛋白样品于－80℃条件下保存备用。
2.1 突变体TFEB S114A原核表达载体的构建以重组质粒pGEX-6p-1-TFEB为PCR模板，以F和Rn为引物进行PCR反应，获得约360 bp的特异性条带，该条带即为含突变位点TFEB分子的上游基因片段；
以Fn和R为引物进行PCR扩增，获得约1 071 bp的特异性条带，该条带为含突变位点TFEB分子的下游基因片段，见图2A。基因片段大小与预期相符。经1%琼脂糖凝胶电泳纯化后的上、下游基因片段为模板，以F和R为引物进行第3步PCR，获得约1 431 bp的特异性条带，与预期条带大小相符，见图2B。将该片段连接至载体pGEX-6p-1上获得重组质粒pGEX-6p-1-TFEB S114A。双酶切鉴定载体连接正确，酶切产物电泳后出现约2 700 bp载体片段和1 431 bp突变TFEB插入片段条带，与预期结果一致，见图2C。DNA测序分析结果显示：目的位点突变成功，已由丝氨酸密码子TCT突变为丙氨酸密码子GCT，见图2D。
图2 突变TFEB S114A片段克隆与鉴定Fig.2 Cloning and identification of mutant TFEB S114A fragment
2.2 TFEB和突变体TFEB S114A诱导表达及纯化实验通过对IPTG浓度、温度和时间等条件的优化，成功诱导出野生型和S114A突变型TFEB蛋白，并且最佳诱导表达条件为0.5 mmol·L－1IPTG在16℃低温条件下诱导过夜，见图3A。纯化后野生型和S114A突变型TFEB蛋白采用BSA进行半定量，结果显示：得到纯度较高的重组蛋白，纯化后蛋白浓度约为10 g·L－1，见图3B。
图3 融合蛋白GST-TFEB和GST-TFEB S114A表达纯化电泳图Fig.3 Electrophoregram of expression and purification of fusion proteins GST-TFEB and GST-TFEB S114A
TFEB在 自 噬 溶 酶 体 通 路 （autophagylysosomal pathway，ALP）调控过程中发挥重要作用［14-16］。在 细 胞 和 动 物 水 平 的 研 究［17-21］证 实：TFEB蛋白中特定丝氨酸残基的磷酸化是调节其亚细胞定位及其蛋白质相互作用的重要机制，研究TFEB的磷酸化状态是进一步分析其功能变化的重要前提。
定点突变技术已逐渐成为研究蛋白质结构及其功能的有力工具。目前基因定点突变技术主要包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式定点突变和PCR介导的定点突变。基于SOE PCR技术的定点突变是利用互补引物（含点突变、插入或缺失等）使2种PCR产物通过重叠链的退火延伸，并在扩增反应中使片段拼接获得突变产物的高效、便捷的PCR定点突变技术。与其他定点突变技术比较，该技术不需要限制性内切酶消化和连接酶处理，可以很快获得依靠其他限制性内切酶消化方法难以获得的产物。此外，该技术还可以在外侧引物的两端设计酶切位点，更有利于进一步的连接克隆，且成功率较高，目前广泛应用于定点突变和基因重组等方面［22-23］。本 研 究 采 用SOE PCR技 术 在 体 外 将TFEB的丝氨酸114位点突变为无法被磷酸化的丙氨酸。设计突变引物时需保证2条引物之间至少有20 bp的碱基互补区。此外，为防止PCR过程中错搭，突变引物Tm值不能低于60℃。本研究中突变引物Fn和Rn长度均为31 bp并且完全重叠，符合突变引物设计原则。
为了提高可溶性蛋白表达水平，本研究从诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG浓度3个方面进行了优化，结果显示：0.5 mmol·L－1IPTG、16℃诱导过夜可获得较多可溶性蛋白。诱导温度可影响重组蛋白的诱导表达及蛋白的可溶性［24］。部分蛋白在高温诱导表达时容易出现错误性折叠，从而形成包涵体沉淀，而低温诱导有助于蛋白的可溶性表达［25］。本文作者也发现在16℃诱导条件下形成的包涵体较少。IPTG作为一种强诱导剂，在菌体中无法被代谢，可以持续地发挥作用。研究［26］显示：高浓度IPTG对菌株有一定的毒性作用，而较低浓度IPTG可以适当地降低转录速率，更有利于蛋白的可溶性表达。本研究结果显示：IPTG浓度对野生型和S114A突变型TFEB蛋白表达无明显影响，最终选择0.5 mmol·L－1IPTG作为TFEB蛋白的诱导浓度。
综上所述，本研究以pGEX-6p-1-TFEB原核表达质粒为模板，通过体外定点突变技术将TFEB丝氨酸114位点突变为无法被磷酸化的丙氨酸，并通过E.coli体外诱导表达系统成功诱导并纯化出带有GST标签的野生型和突变型TFEB，为进一步了解TFEB在相关疾病中的功能和机制提供了实验依据。
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