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张 宁，刘怡文，原 翔，孔金玉，杨 洪，梁梦夏，周福有
1)河南科技大学临床医学院；
河南科技大学第一附属医院分子生物实验室；
河南科技大学肿瘤研究所；
河南省肿瘤表观遗传学重点实验室 河南洛阳 471000 2)河南科技大学体育学院 河南洛阳 471000 3)河南科技大学附属安阳市肿瘤医院胸外二病区;河南省食管癌精准防治医学重点实验室 河南安阳 455000
食管癌具有极高发病率及死亡率[1]，全球每年新增约50万例，超一半发生在我国[2]。鳞状细胞癌(鳞癌)是食管癌中最为常见的组织学类型，占食管癌总数95%以上。食管鳞癌预后极差，虽然传统的手术、放化疗以及靶向治疗、免疫治疗等手段不断更新，但中晚期食管鳞癌5 a生存率仍低于20%[3]。食管鳞癌的病因至今尚不完全明确，其危险因素主要包括吸烟、饮酒、饮食、慢性感染、免疫功能紊乱及遗传易感性等。
研究[4-6]表明，多种病原微生物均可通过长期定植于机体促进肿瘤的发生发展；
而清除病原微生物有助于控制肿瘤的恶性进展。具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，Fn)作为定植于口腔的条件致病菌，其数量改变可引起微生态失衡[7]。由于口腔颌面部静脉瓣膜缺如，Fn可随血液循环轻易播散至全身，参与多种疾病进程[8]，且与多种肿瘤发生发展密切相关[9]。研究[10]显示，食管癌前病变组织中Fn含量丰富，且有Fn感染的食管鳞癌患者生存期显著缩短[11]，Fn与食管鳞癌的恶性进展密切相关。前期关于Fn感染与食管鳞癌的相关研究大都集中在癌细胞自身，有关肿瘤微环境的作用则探讨不多。实际上，肿瘤的发生发展与肿瘤微环境密切相关[12-13]。肿瘤微环境不仅为肿瘤的恶性行为提供了丰富的物质基础，且能调控免疫细胞，使其无法发挥正常功能，导致肿瘤细胞免疫逃逸[14]。调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)所介导的免疫抑制是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一，更是肿瘤免疫治疗中的关键障碍[15-16]。Treg是具有免疫抑制功能的T细胞亚群，在维持机体免疫耐受和调控免疫应答水平方面发挥了重要作用[17]。临床资料[18-21]显示，多种肿瘤中病原微生物均能招募Treg。因此推测Fn可能通过招募Treg而使癌细胞发生免疫逃逸，从而促进食管鳞癌的恶性进展。
本研究分别采用RNAscope及免疫组化法检测食管鳞癌组织中Fn感染及Treg浸润情况，分析Fn对Treg的招募效应及其与临床病理特征和生存预后的相关性，为食管鳞癌的治疗提供新策略和治疗手段。
1.1 研究对象收集2013年7月至2014年6月安阳市肿瘤医院手术切除的食管鳞癌患者癌组织石蜡包埋标本。病例纳入标准：①术前均未接受放化疗或免疫治疗。②治疗性食管鳞癌切除术后。③术后病理诊断明确为食管鳞癌。④病历资料全面。⑤随访时间60个月。患者术后常规进行化疗，均未接受放疗或免疫治疗。本研究经安阳市肿瘤医院伦理委员会审核批准，并于术前获得患者书面知情同意。
1.2 主要仪器与试剂Fn(16S rRNA)特异性探针与RNAscope试剂盒(美国ACD公司)，光学显微镜(日本尼康公司)，SP-9000免疫组化试剂盒(中国北京中杉金桥生物技术有限公司)，CD4、CD25与FoxP3兔多克隆抗体(美国Abcam公司)，柠檬酸抗原修复液、PBS、DAB显色剂(中国上海索莱宝生物技术有限公司)。
1.3 食管鳞癌组织中Fn感染的RNAscope检测实验流程参考文献[22]。取常规石蜡包埋的食管鳞癌组织标本块，以3 μm厚连续切片；
60 ℃溶蜡，二甲苯脱蜡，制备靶标修复试剂，RNAscope双氧水处理，画疏水圈，RNAscope蛋白酶Plus处理，进行RNAscope杂交显色。
1.4 食管鳞癌组织中Treg浸润情况的免疫组化检测取常规石蜡包埋的食管鳞癌组织标本块，3 μm厚连续切片；
60 ℃溶蜡后立即放入二甲苯脱蜡(3次，10 min/次)，依次梯度乙醇(体积分数100%、95%、90%、85%)水化各5 min后流水冲洗1 min；
94～98 ℃柠檬酸盐缓冲液抗原修复15 min，PBS冲洗(3次，3 min/次)；
过氧化物酶阻断剂封闭10 min，PBS冲洗(3次，3 min/次)；
滴加正常山羊血清避光封闭30 min；
取3张连续切片，分别加入CD4、CD25及FoxP3特异性一抗(按1∶200稀释)各50 μL，4 ℃孵育过夜；
次日复温1 h，PBS冲洗(3次，3 min/次)；
滴加山羊抗鼠/兔聚合物室温下孵育30 min；
PBS冲洗(3次，3 min/次)；
链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶室温下封闭；
PBS冲洗(3次，3 min/次)；
DAB显色，蒸馏水终止显色；
苏木精复染；
梯度乙醇脱水(体积分数85%、90%、95%、100%)各1 min；
二甲苯透明(3次，3 min/次)；
风干后中性树胶封片。
1.5 结果判读RNAscope结果判定[22]：Fn(16S rRNA)信号表达于肿瘤细胞中，呈红色颗粒状。每个细胞中红色颗粒≥8个或有成簇的信号为阳性细胞；
每张切片中阳性细胞百分比≥30%为阳性标本。
免疫组化结果判定[23]：以两位资深病理科医生共同判定的阳性切片为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。于光学显微镜下选取5个400倍视野，观察3张食管鳞癌组织连续切片中同一位置。出现浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为Treg浸润阳性。取5个视野评分的均值为最终免疫组化评分，0分定义为阴性，1～12分定义为阳性。
分组：4张连续切片中Fn、CD4、CD25及FoxP3同时判定为阳性的标本，为Fn招募Treg(Fn+Treg)阳性；
不满足同时阳性者为阴性。
1.6 统计学处理采用SPSS 25.0进行数据分析。①应用χ2检验分析食管鳞癌组织中Fn感染与Treg浸润的关联性以及Fn+Treg阳性组与阴性组食管鳞癌患者临床病理特征。②生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法。③生存分析采用Log-rank检验。④利用Cox回归分析食管鳞癌患者预后影响因素。⑤检验水准α=0.05。本研究中124例食管鳞癌患者的生存时间为入院时间至最后一次随访日期或死亡；
删失数据为随访至60个月仍存活的患者，未删失数据为由食管鳞癌导致的死亡患者。
2.1 食管鳞癌患者的一般资料本研究共纳入124例食管鳞癌患者，其中男82例，女42例；
≤60岁70例，>60岁54例；
有吸烟史63例；
有饮酒史60例；
低分化26例，中高分化98例；
侵及外膜85例，未侵及外膜39例；
有淋巴结转移54例，无淋巴结转移70例；
临床分期Ⅰ/Ⅱ期48例，Ⅲ/Ⅳ期76例。
2.2 食管鳞癌组织中Fn感染及Treg浸润情况见图1。食管鳞癌组织中可见癌细胞胞质出现红色颗粒，为Fn感染阳性；
右侧连续切片中可见同一位置淋巴细胞胞膜(CD4与CD25)或胞核(FoxP3)同时出现棕黄色颗粒，为Treg浸润阳性；
且Fn感染与Treg浸润有关(表1)。
2.3 Fn+Treg阳性组与阴性组食管鳞癌患者临床病理特征比较见表2。
2.4 食管鳞癌患者预后影响因素的Cox回归分析124例食管鳞癌患者成功完成术后随访。以食管鳞癌导致的死亡为终点事件，以Fn+Treg(阳性=1，阴性=0)、性别(“男”=1,“女”=0)、年龄(“>60岁”=1，“≤60 岁”=0)、吸烟(“有”=1，“无”=0)、饮酒(“有”=1,“无”=0)、分化程度(“低分化”=1，“中高分化”=0)、浸润深度(“侵及外膜”=1，“未侵及外膜”=0)、淋巴结转移(“有”=1,“无”=0)、临床分期(“Ⅲ/Ⅳ期”=1，“Ⅰ/Ⅱ期”=0)为自变量。纳入混杂因素(性别与年龄)，并选择单因素分析中与食管鳞癌有统计学关联的变量进行多因素Cox回归分析，结果显示分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期及Fn+Treg阳性是影响食管鳞癌预后的危险因素(P<0.05)(表3)。
表3 食管鳞癌患者预后影响因素的Cox回归分析
2.5 Fn+Treg阳性组与阴性组食管鳞癌患者5 a生存预后相关性分析结果两组患者生存曲线见图2。Fn+Treg阳性组5 a生存率及中位生存时间[15.79%、24.50(14.17,40.75)个月]低于阴性组[37.21%、44.00(24.75,60.00)个月]，差异有统计学意义(χ2=11.234，P<0.001)。
图2 Fn+Treg阳性组与阴性组食管鳞癌患者生存曲线
食管鳞癌的发病率与病死率较高，早期诊断困难，预后极差。因此，寻找精准的早期指标、有效的预防措施及靶向治疗方法尤为重要。长期以来，肿瘤研究中与病原微生物有关的慢性感染探讨的不多。实际上，多种病原微生物均可通过重塑宿主免疫微环境，在肿瘤细胞中长期定植，导致肿瘤免疫逃逸，促进其恶性进展[24]。而Fn作为毒力最强的口腔致病菌之一[25]，其内毒素能抑制机体免疫应答，从而长期定植于机体，促进口腔鳞癌、食管鳞癌以及结肠癌等多种肿瘤的恶性进展[26]。
病原微生物对肿瘤微环境的重塑机制至今尚未完全明确，但多数可招募Treg，通过细胞间抑制机制以及分泌免疫抑制分子，使机体抗肿瘤免疫失能，从而长期定植并协助肿瘤细胞免疫逃逸[27-28]。幽门螺杆菌感染阳性的胃癌患者胃黏膜中Treg数量多于正常人群，使机体处于免疫抑制状态[29]，促进癌细胞恶性增殖；
乙肝病毒感染的肝癌患者的癌细胞可通过上调TGF-β蛋白，大量招募Treg，从而诱导癌细胞免疫逃逸[30]；
EB病毒感染阳性的霍奇金淋巴瘤患者的癌细胞可通过EB病毒核心抗原EBNA1而使趋化因子CCL20高表达，从而招募Treg[31]，协助癌细胞逃避免疫监视。
本研究发现：食管鳞癌组织中Fn感染与Treg浸润有关，提示Fn可能通过招募Treg，抑制免疫反应，从而长期定植。本研究结果显示，Fn+Treg阳性组多为吸烟、饮酒的男性患者，表明长期吸烟、饮酒导致口腔环境恶劣，Fn更容易感染并定植，从而招募大量Treg；
低分化食管鳞癌组织中Fn+Treg阳性率高于中高分化组织，提示Fn对Treg的招募效应可能与肿瘤的恶性程度相关；
同时该效应与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和临床分期有关，提示该效应可能促进了肿瘤的恶性进展。本研究还发现分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期及Fn+Treg阳性是影响食管鳞癌预后的危险因素，且Fn+Treg阳性组患者5 a生存率及中位生存时间均低于阴性组，提示有效清除Fn并抑制Treg富集可能会延长食管鳞癌患者生存期。
由于肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的演变过程，Fn的具体致病机制有待进一步探讨，但打破Fn在宿主体内持久定植的现状，并有效抑制Treg的大量富集，对于延缓食管鳞癌恶性进展并延长患者生存期具有非常重要的意义。
综上所述，在食管鳞癌组织中Fn可能通过诱导或招募Treg，为自身持续感染提供有利微环境，从而促进肿瘤进展。有效清除Fn并抑制Treg富集可能延长食管鳞癌患者的生存期，在食管鳞癌的临床治疗方面具有十分重要的理论意义和广泛的应用前景。
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