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黄克让，王 珍，陈 蕾，崔凤展，彭潔莹，张 敏
（西北农林科技大学 实验室安全与条件保障处 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）
冷冻扫描电子显微镜（Cryo-scanning electron microscope，Cryo-SEM）是在常规扫描电子显微镜上加装冷冻样品台、传输及超低温冷冻制样系统的低温样品微观形貌表征高端平台[1]，该平台无需对样品进行干燥处理，可以直接观察动植物[2-6]、乳液[7]、泡沫[8]等含水样品. Cryo-SEM能够规避空气自然干燥法导致的严重皱缩和变形，同时可弥补常规处理方法的一些缺点，如临界点干燥或冷冻干燥法中存在一定程度的皱缩失真、易溶成分丢失、制备过程慢、不能制作液体和半液体以及对电子束敏感的样品等问题. 同时，采用先进的Cryo-SEM方法，样品无需经过临界点干燥等处理过程，直接冷冻观察，是一个快速高效地解决方法，是国内外较为重视的一种电子显微镜技术发展方向[9]. 但由于仪器的价格昂贵，其应用还不广泛. 且Cryo-SEM的制样和操作过程对技术人员的试验技术要求较高，需要其熟悉各类样品的升华温度、升华时间、冷态温度、观察电压等试验条件，能根据研究目的快速高效地选择合适的操作条件，以捕捉快速变化的样品表面信息. 目前尚未见到Cryo-SEM相关的制样方法手册和图集，仅能从文献中获得少量信息[10]，Cryo-SEM冷冻断裂法观察生物样品的相关试验方法和图集更少. 结合近5年Cryo-SEM试验经验，本文以液体[以乳清蛋白纤维（WPIF）为例]和植物（以沙漠梭梭成熟分支中上部同化枝为例）为试验材料，对样品进行冷冻断裂，并通过扫描电子显微镜观察，希望可以为相关研究者提供试验技术参考.
Cryo-SEM的关键是超低温冷冻制样和冷冻传输技术. 超低温快速冷冻制样技术包括超低温样品固定和低温样品处理，超低温样品固定是物理固定.水除了气态、液态和固态外，还有玻璃态，水大约在166 K可以转变成玻璃态. 玻璃态是一种过冷的液态，即液态水在零下摄氏度不结冰保持液态. 玻璃态的水和冰不一样，它无固定形状，不存在晶体结构. 与固态相比，它更像种极端粘滞、呈现固态的液体. 水的玻璃态密度与液态密度相同[11]. 超低温快速冷冻制样可使水呈玻璃态，避免冰晶的产生对样品本身结构产生破坏，利用超低温快速冷冻完成样品的固态化，保持生物样品在生物体原来状态，相对于化学固定具有固定速度快、效果好、无需使用戊二醛及锇酸等有毒化学试剂等优点. 样品处理在低温样品处理舱室进行冷冻断裂、升华（刻蚀）、镀膜处理. 冷冻传输系统是在真空状态下将处理好的样品转移到电子显微镜样品舱中的冷台以供观察.
冷冻断裂法是低温冷冻制样关键技术，在处理舱室，采用冷刀切断. 低温断裂是一种脆性断裂，断裂过程中基本上不发生塑弹性变形. 通过冷冻断裂可以观察样品断口和样品内部结构信息，广泛的应用于生物样品和含水软组织样品，断裂角度和部位是保证试验是否成功的关键.
2. 1 仪器与试剂
Nano SEM-450扫描电子显微镜[美国赛默飞（FEI）公司]配PP3010T型号冷冻传输（英国Quorum 公司）；
梭梭种子采于新疆古尔班通古特沙漠边缘；
冷冻保护剂生产厂家为Scigen Scientific Gardena；
石墨烯生产厂家为Agar Scientific；
乳清蛋白生产厂家为Southwest Cheese Company；
中链甘油三酯MCT生产厂家为北京易秀博谷生物科技有限公司.
2. 2 Cryo-SEM的操作流程
Cryo-SEM的操作流程如图1所示：（1）样品采用冷冻保护剂和石墨烯按1∶1混合装载于样品托上. （2）将装有样品的样品台装载到传输装置上.（3）对固定样品的预冷室抽真空，使液氮变过冷液氮（−210 ℃雪泥状）. 将样品插入−210 ℃的过冷液氮雪泥中快速冷冻固定，水转化为玻璃态，避免形成冰晶. （4）继续抽真空至再次出现雪泥，将样品提至转移仓，真空下转移. （5）将样品转移安装在扫描电子显微镜样品舱端口上的制样舱中的冷台上，与制备腔室气锁对接. （6）根据需要进行冷冻断裂、冷冻升华刻蚀和溅射镀膜等处理. （7）在真空条件下，将样品转移至扫描电子显微镜样品舱中的冷台上.（8）进行超微结构观察和拍照.
图1 冷冻扫描电镜工作流程Fig. 1 Workflow of Cryo-SEM
3. 1 Cryo-SEM观察WPIF
3. 1. 1 乳清分离蛋白的制备
称取4.0 g乳清分离蛋白（WPI）溶解于200 mL的超纯水中，配制成质量浓度为20.0 mg/mL的蛋白分散液，磁力搅拌2 h使其充分溶解，在4 ℃、8 000 r/min下离心15 min去除不溶性物质. 上清液采用4.0 mol/L HCl调节pH为2.0，4 ℃下磁力搅拌水合过夜. 水合后的分散液置于85 ℃的水浴条件下孵育22 h（300 r/min的磁力搅拌）. 加热结束后的样品立即在冰水浴中冷却至室温，制备得到WPIF分散液，测定加热后WPIF的初始pH值，4 ℃条件下储存备用.
3. 1. 2 乳清分离蛋白纤维稳定乳液的制备
将20.0 mg/mL的WPIF分散液（初始pH值为2.5）作为乳化剂相，中链甘油三酯（MCT）作为油相，添加体积分数为20%，使用高速剪切机于14 000 r/min下剪切3 min，制备得到乳液.
3. 1. 3 样品处理及试验条件
将冷冻后样品进行冷冻断裂和未冷冻断裂对比，具体采用的试验条件如表1所列.
表1 乳清蛋白纤维样品冷冻断裂和未冷冻断裂的试验条件Table 1 Experimental conditions of frozen and unfrozen fracture of whey protein fiber samples
3. 1. 4 试验结果
由图2可见，冷冻断裂后能看到乳液内部截面结构，包括连续相和液滴的表面. 未断裂只能看到冷冻样品的平整外表面，无法观察内部结构. 如图2（a）所示，只能看到油相被包裹在内部，纤维堆积无法观察到. 图2（b）中乳液液滴内部的油相（中链甘油三酯）表面形貌清楚可见，可以观测到乳液液滴内部的油相（中链甘油三酯）排列结构，油滴形貌及大小. 图2（c）是连续相中的乳清分离蛋白纤维堆积而成的片层结构，可以观察到乳清分离蛋白纤维的堆积方式和堆积形状. 通过观察乳清分离蛋白纤维内部的超微结构，可以为科研工作者提供改变其内部结构的依据，进而改变其性质，并将其作为乳化剂应用于食品胶体[12]领域.
图2 冷冻断裂前后乳清分离蛋白乳液内部结构（a）未进行冷冻断裂（13 000×，Bar=10 µm），（b）冷冻断裂处理（2 000×，Bar=50 µm），（c）冷冻断裂（12 000×，Bar=10 µm）Fig. 2 Internal structure of whey protein isolate emulsion before and after freezing fracture(a) before freezing fracture (13 000×, Bar=10 µm), (b) performing freeze fracture (2 000×, Bar=50 µm),(c) after freezing fracture (12 000×，Bar=10 µm)
3. 2 Cryo-SEM观察植物样品
3. 2. 1 材料制备
选取饱满、大小均匀的梭梭种子播种于花盆中，以清水冲洗后的干净河沙为培养基质，于科研温室培养（14 h自然光照/10 h黑暗，昼夜温度为28 ℃/20 ℃，相对湿度为45%）. 待子叶出土后，每两天浇灌1/2 Hoagland营养液（pH为6.6~6.8），子叶伸长生长一周后采集样本. 初生真叶采于刚发生两片子叶之间的同化枝（0.5 cm左右，10~15 d），整株成熟期采集生长3个月大的梭梭幼苗，取成熟分支中上部同化枝为待分析样本.
3. 2. 2 样品处理及试验条件
将冷冻后样品进行冷冻断裂和未冷冻断裂对比，具体采用的试验条件如表2所列.
表2 梭梭成熟分支中上部同化枝样品冷冻断裂和未冷冻断裂的试验条件Table 2 Experimental conditions of frozen and unfrozen fracture of middle and upper assimilation branches of mature branches of Haloxylon Ammodendron
3. 2. 3 试验结果
图3（a）是锋利刀片割断后冷冻放大200倍的图像，可以看出使用锋利的刀片割断存在机械损伤，断裂处细胞皱缩，细胞破损细胞液流失. 图3（b）为冷冻断裂后放大500倍观察到的Cryo-SEM图像，可以看出冷冻断裂属于冷冻脆断，断裂后组织和细胞饱满，除冷刀接触的部位有小部分机械损伤外，其它部分不会受损. 图3（c）为冷冻断裂后13 000倍放大下植物细胞内部亚细胞器图像，可以清晰观察到细胞内部的叶绿体及叶绿体内的内囊体等超微结构，之前都是通过透射电子显微镜才能观察. 图3（d）为冷冻断裂后15 000倍放大下的植物细胞外形态，可以观察到细胞间的细毛组织栩栩如生. 因此冷冻断裂法可以为科研工作者在观察及研究植物组织细胞间及细胞内超微结构方面提供帮助.
图3 冷冻断裂前后梭梭成熟分支中上部同化枝图像（a）锋利刀片割断后梭梭真叶（200×，Bar=500 µm），（b）冷冻断裂后梭梭真叶（500×，Bar=300 µm），（c）冷冻断裂后梭梭真叶内部亚细胞器（13 000×，Bar=10 µm），（d）冷冻断裂后冷梭梭子叶（15 000×，Bar=10 µm）Fig. 3 Images of middle and upper assimilation branches of mature branches of Haloxylon Ammodendron before and after freezing fracture(a) euphylla of Haloxylon Ammodendron after cutting by sharp blade (200×, Bar=500 µm), (b) euphylla of Haloxylon Ammodendron after freezing fracture (500×, Bar=300 µm), (c) internal subcellular organelles of euphylla of Haloxylon Ammodendron after freezing fracture (13 000×，Bar=10 µm), (d) cotyledon of Haloxylon Ammodendron after freezing fracture (15 000×，Bar=10 µm)
Cryo-SEM可以直接观察含水或其它液体成分样品，是研究高度含水生物和材料样品的强有力工具. 能否高效获得高质量的Cryo-SEM图像，取决于合理的样品制样方式和制样条件[13-15]. 冷冻断裂法主要应用于断口和样品内部结构观察. 相比未断裂样品，液体样品断裂时，升华（刻蚀）温度较低，升华时间较短，一般升华温度为−80~ −100 ℃，升华时间在1~20 min之间. 若样品含水量较高，温度应适当升高，时间也应适当增加. 植物样品断裂时，升华温度均为−100 ℃，升华时间为10 min.
Cryo-SEM的样品制备快速简单且可以直接观察含水样品，是研究高度含水生物材料的强有力工具. 能够直接观察液体和半液体以及对电子束敏感的样品，弥补生物样品在空气中因自然干燥法导致的严重皱缩和变形的缺点. 常规处理方法（如临界点干燥或冷冻干燥法）仍存在一定程度的皱缩失真、易溶成分丢失、制备过程慢等缺点. 图4（a）（c）是临界点干燥处理的植物叶片和菌丝，观察发现样品有严重的皱缩失真. 图4（b）（d）是Cryo-SEM 观察的植物叶片和菌丝, 观察发现与图4（a）（c）相比，其形态饱满、无塌陷皱缩，表面自然状态形貌清晰可见.
图4 生物样品不同制样方法的SEM图像（a）叶片临界点干燥（800×，Bar=200 µm），（b）叶片Cryo-SEM（500×，Bar=300 µm），（c）菌丝临界点干燥（6 000×，Bar=20 µm），（d）菌丝Cryo-SEM（6 000×，Bar=20 µm）Fig. 4 SEM images of biological samples using different preparation methods(a) critical point dried leaves (800×, Bar=200 µm), (b) Cryo-SEM of leaves (500×, Bar=300 µm), (c) critical point dried mycelia (6 000×，Bar=20 µm), (d) Cryo-SEM of mycelia (6 000×, Bar=20 µm)
Cryo-SEM 作为观察微观世界的“科学之眼”，是生命科学研究重要仪器设备之一. 冷冻扫描实验技术是生命科学研究的关键技术，结合 Cryo-SEM冷冻断裂法进行生物类样品表面形貌观察，既能观察到表面结构信息，又可观察样品内部结构信息.例如，冷冻断裂可观察样品内部超微结构及动植物组织的亚细胞结构，具有能在高真空状态下观察含水样品、分辨率高、制样简单快速、可对样品进行断裂刻蚀等优点，是生命科学研究中的有力工具.本文通过对乳清蛋白纤维（WPIF）液体样品、植物样品观察以及临界干燥和冷冻样品处理比较，为科研工作者在冷冻扫描电子显微镜研究中提供技术参考.
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