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晏 英，王 丹，张 雄，彭明友，鄢小燕，徐 冉，李 毅，杨小生
(1.贵州医科大学 药学院/贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心，贵州 贵阳 550004；
2.贵州医科大学 医药卫生管理学院，贵州 贵阳 550025；
3.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550014)
糖尿病是由胰岛素分泌不足引起的一种以高血糖为特征的代谢性疾病，与恶性肿瘤、心血管疾病并称世界三大疾病。近年来，随着环境污染加重、生活方式的改变、人口老龄化加剧等因素导致糖尿病日益恶化，患病人数呈指数增长，且呈现年轻化趋势。
α-葡萄糖苷酶的主要作用是将碳水化合物分解成葡萄糖，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以有效阻断该过程，以此达到控制餐后血糖，有效降低餐后血糖的峰值，是2型糖尿病的有效治疗方案之一。α-葡萄糖苷酶抑制剂安全性高，是少数能干预糖耐量受损的口服降糖药之一，在2型糖尿病治疗中具有明显优势。目前，临床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂有阿卡波糖、米格列醇及伏格列波糖等，但常常会引起严重的肠道副作用而限制使用。我国在中药治疗糖尿病方面历史悠久，大量文献报道多种天然活性成分表现出良好的对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，如皂苷、黄酮、多糖、生物碱等，这些天然来源成分的α-葡萄糖苷酶抑制剂将成为研究与治疗2型糖尿病的潜在资源。
1.1 材料
实验用垫状卷柏采自贵州省贵阳市药用植物园，夏枯草采自贵州省龙里县，由贵州中医药大学陈德媛教授分别鉴定为垫状卷柏()和夏枯草()，标本保存于贵州医科大学药学实验室。α-葡萄糖苷酶对照品(SLBX6245，100UN，美国Sigma公司)、阿卡波糖对照品(J1824027，阿拉丁试剂有限公司)、4-硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG，E1828029，阿拉丁试剂有限公司、其余试剂均为国产分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。
1.2 仪器
Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)、HP8345紫外分光光度仪(美国惠普公司)、MR-96A多功能酶标仪(瑞士TECAN 有限公司)、KQ-100B型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)、BSA224S型电子天平(德国赛多利斯公司)、SQP型十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)、101型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)、HH-2 数显恒温水浴锅(金坛市天瑞仪器有限公司)。
1.3 方法
..垫状卷柏提取物制备
干燥垫状卷柏药材500 g，粉碎，用5倍量95%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩得到95%乙醇浸膏21.8 g，加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物0.12 g，乙酸乙酯萃取物2.1 g，水层17.9 g，另取干燥垫状卷柏药材粉末500 g，用水煎煮2次，每次1 h，得到的垫状卷柏药渣再用5倍量95%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩得到95%乙醇浸膏17.1 g，加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物0.1 g，乙酸乙酯萃取物1.9 g，水层14.3 g。将卷柏各提取物用DMSO溶解，配制成浓度为10 g/L的溶液备用。
..夏枯草提取物制备
干燥夏枯草药材粉末500 g，粉碎，用水煎煮2次，每次1 h，药液合并过大孔树脂柱层析，先用水洗脱得到水层，再用70%乙醇洗脱得到70%乙醇洗脱物，水煎煮后得到的夏枯草药渣再用5倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩得到70%乙醇浸膏23.6 g，加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物0.14 g，乙酸乙酯萃取物2.5 g，水层19.2 g。将夏枯草各提取物用DMSO溶解，配制成浓度为10 g/L的溶液备用。
..α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
先后迎接全国人大执法检查组、国家食品药品监管总局等国家、省、市有关部门各级领导莅临检查指导62次，食品药品监管工作受到各界一致肯定，实现了食品药品安全“零事故”—西安市未央区食品药品监督管理局取得的这一成绩无疑使人振奋。近年来，该局始终坚持以习近平总书记指示的“四个最严”要求为纲领，凝心聚力，真抓实干，依法行政，科学监管，切实提升食品药品安全监管能力。2016年5月，未央区被省政府授予“省级食品安全示范区”荣誉称号；
区食品药品监管局荣获了市、区目标责任考核及政风行风建设优秀单位称号，局党支部被区委授予“先进基层党组织”。
建立pNPG的体外评价模型进行活性测试。将垫状卷柏和夏枯草提取物配制成不同浓度的样品溶液，试验分为空白组、空白对照组、样品组、样品空白组。空白组在96孔板中加PBS溶液10 μL，空白对照组在96孔板中加DMSO代替样液10 μL，样品组、样品空白组在96孔板中加DMSO溶解的样液10 μL，每组3复孔，分别加入60 μL 0.1 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.8)，空白对照组和样品空白组加入10 μL 0.1 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.8)，其他各组加入10 μL α-葡萄糖苷酶磷酸缓冲溶液(2 U/mL)，在恒温振荡器中37 ℃保温15 min后取出，随即加入20 μL 5 mmol/L pNPG溶液，充分混匀，于37 ℃孵育20 min，结束后加入50 μL 0.1 mol/L的NaCO终止反应。以阿卡波糖为阳性对照，在405 nm处测定吸光值，酶抑制率I % = [(A-A)-(A-A) / A-A]×100(A1：空白组吸光值，A2：空白对照组吸光值，A3：样品组吸光值，A4：样品空白组吸光值)，计算出各样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率，求出相应的IC值。
..垫状卷柏和夏枯草高活性部位的确定
将垫状卷柏、夏枯草的各提取物及阳性对照物阿卡波糖配制成不同质量浓度的样品液，按照“..”方法分别测定不同浓度垫状卷柏和夏枯草各提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制活性最高的提取物为α-葡萄糖苷酶抑制活性的高活性部位。
..α-葡萄糖苷酶抑制的抑制动力学分析
按照“..”方法分别测定不同浓度垫状卷柏和夏枯草高活性部位与酶浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 U/mL时反应的初速度，底物最终浓度为0.5 mmol/L，每个浓度重复三次，以酶浓度E(U/mL)为横坐标，反应初速度(ΔOD/min)为纵坐标作图，利用图的特征推断酶的结合方式。垫状卷柏和夏枯草高活性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制类型由Linewaver-Burk方法确定。配制不同浓度的垫状卷柏和夏枯草高活性部位，分别与浓度为4.0、5.0、6.0、8.0、10.0 mmol/L的底物溶液，混匀，加入0.8 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，测定α-葡萄糖苷酶抑制的反应速率。以底物浓度的倒数1/[]为横坐标，1/为纵坐标进行Lineweave-Burk双倒数作图分析。以直线的斜率和对轴的截距分别对垫状卷柏和夏枯草高活性部位浓度二次作图，分别求出垫状卷柏和夏枯草高活性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制常数()和对酶—底物络合物抑制常数()，由此判断酶的抑制类型。
..垫状卷柏和夏枯草高活性部位的组合效应
根据两种药物的组合原则，在垫状卷柏和夏枯草高活性部位称样量恒定的前提下，确定7种不同的组合方式，如表1所示。采用“..α-葡萄糖苷酶抑制活性测定”的方法，对垫状卷柏和夏枯草高活性部位的组合方式测定抑制活性，并计算IC值。采用抑制浓度的分数之和值(SFIC)及等效剂量分析方法评价联合用药的作用性质。抑制浓度的分数之和(SFIC)按以下公式计算：SFIC=一个药物联用时的IC值/这个药物单用时的IC值+另一药物联用时的IC值/另一药物单用时的IC值。当SFIC值小于、大于或者是等于1.0，则分别被认为两者联用时具有增效﹑拮抗和相加作用。另外得到相应的等效剂量分析图，如果折线图呈现凹形或凸型则认为联用时两药物相互作用的本质为增效或拮抗作用。
表1 JYC与XXT的配比组合Tab.1 The ratio of JYC and XXT
2.1 垫状卷柏各提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
垫状卷柏各提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用结果见表2。试验结果表明，除了垫状卷柏水提物及其过大孔树脂后水洗脱部分外，阿卡波糖和垫状卷柏各提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈现随着剂量升高而增强的趋势。其中垫状卷柏植物水提后95%醇提物的乙酸乙酯萃取物，垫状卷柏植物95%醇提物的乙酸乙酯萃取物的抑制作用明显强于阳性药阿卡波糖，且垫状卷柏植物95%醇提物的乙酸乙酯萃取物JYC的抑制作用最强，为垫状卷柏高活性部位。
表2 垫状卷柏提取物的α-葡萄糖苷酶活性筛选结果Tab.2 The α-glucosidase inhibition activity of extracts from Selaginella tamariscina
2.2 夏枯草各提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
夏枯草各提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用结果见表3。试验结果表明，夏枯草水提物的大孔树脂70%乙醇洗脱物，夏枯草水提后70%醇提物，夏枯草水提后70%乙醇提取物得乙酸乙酯萃取物的抑制作用明显强于阳性药阿卡波糖，且夏枯草水提物的大孔树脂70%乙醇洗脱物XXT的抑制作用最强，为夏枯草的高活性部位。
表3 夏枯草粗提物部分的α-葡萄糖苷酶活性筛选结果Tab.3 Theα-glucosidase inhibition activity of extracts from Prunella vulgaris Linn
2.3 垫状卷柏和夏枯草高活性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制机制分析
不同浓度的高活性部位，改变酶的浓度，通过酶活力对不同浓度的酶作图得到一组直线，如图1和图2。所有的直线均呈线性关系，且经过原点。另外，随着提取物浓度的增加，直线的斜率在减小，说明垫状卷柏和夏枯草高活性部位浓度，没有改变酶的数量，而是降低了酶的活性。因此，垫状卷柏和夏枯草高活性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。
图1 垫状卷柏高活性部位酶浓度与反应初速率图Fig.1 Relationship between enzyme concentration and initial reaction velocity of the most effective part from Selaginella pulvinata
图2 夏枯草高活性部位酶浓度与反应初速率图Fig.2 Relationship between enzyme concentration and initial reaction velocity of the most effective part from Prunella vulgaris
2.4 垫状卷柏和夏枯草高活性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学研究
采用酶动力学方法探讨垫状卷柏和夏枯草高活性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制机制。根据Lineweaver-Burk双倒曲线作图法，分别作出阿卡波糖、垫状卷柏和夏枯草高活性部位的抑制动力学曲线，确定抑制类型和抑制常数。如图3、图4和图5所示，分析发现，阿卡波糖所有直线与Y轴相交于一点，说明阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶属于竞争性抑制。垫状卷柏和夏枯草高活性部位的Lineweaver-Burk 曲线均为一组相交于第二象限的直线，随着体系中垫状卷柏和夏枯草高活性部位浓度增大，减小，米氏常数()增大，表现为混合I型竞争抑制。结果表明，垫状卷柏和夏枯草高活性部位同时与结合酶(ES)及游离酶(E)结合，且抑制常数>。以双倒数直线的斜率和截距分别对垫状卷柏和夏枯草高活性部位浓度作图(图4b、4c、5b、5c)，均为直线，分别求得垫状卷柏高活性部位的=0.022 μg/mL，=0.040 μg/mL，夏枯草高活性部位的=0.010 μg/mL，=0.017 μg/mL。竞争性抑制作用强于反竞争性抑制作用，垫状卷柏和夏枯草高活性部位对游离酶的抑制作用强于其对酶—底物复合物的抑制作用。
图3 阿卡波糖Lineweaver-Burk双倒数曲线Fig.3 Lineweaver-Burk plot of acarbose
注：a为曲线中垫状卷柏高活性部位浓度图；
b为斜率对样液浓度作图；
c为截距对样液浓度作图。图4 Lineweaver-Burk图法测定垫状卷柏高活性部位抑制α-葡萄糖苷酶的机制Fig.4 Lineweaver-Burk plot for the determination of the inhibitory mechanism of the most effective part from Selaginella pulvinate on α-glucosidase
注：a为夏枯草高活性部位浓度图；
b为斜率对样液浓度作图；
c为截距对样液浓度作图。图5 Lineweaver-Burk图法测定夏枯草高活性部位抑制α-葡萄糖苷酶的机制Fig.5 Lineweaver-Burk plot for the determination of the inhibitory mechanism of the most effective part from Prunella vulgaris on α-glucosidase
2.5 垫状卷柏和夏枯草高活性部位的组合效应
..JYC与XXT配比组合的α-葡萄糖苷酶的抑制活性
将JYC与XXT 7种配比组合分别配制成不同质量浓度的样品液，阳性对照品阿卡波糖制备成质量浓度分别为10、1、0.1 μmol/mL。JYC与XXT7种配比组合和阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性及IC值见表4，结果显示，JYC与XXT的7种配比组合的α-葡萄糖苷酶抑制活性均明显强于阳性对照阿卡波糖，当JYC与XXT按1∶3组合时，α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，为最佳组合。
表4 JYC与XXT的抑制活性筛选结果Tab.4 The α-glucosidase inhibition activity of JYC and XXT
..JYC与 XXT组合效应的计算
JYC与XXT配比组合的SFIC和和FIC值(药物联用时的IC值/这个药物单用时的IC值)，见表5，结果显示，当JYC与XXT配比为5∶1、3∶1、1∶1时，各组SFIC值均小于1.0，两者具有协同增效的α-葡萄糖苷酶抑制活性，当JYC与XXT配比为1∶3、1∶5时，各组SFIC值约等于1.0，两者具有协同相加的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
表5 JYC与XXT的组合计算结果Tab.5 The result of combination between JYC and XXT
用JYC的FIC值(联用时的IC值/单用时的IC值)对应图中横坐标值，同时用XXT的FIC值对应图中纵坐标值作折线图，得出的等效剂量分析图呈现凹形(图6)，说明JYC和XXT联用时的相互作用本质为增效作用。
图6 JYC与XXT对α-葡萄糖苷酶抑制作用等效剂量分系图Fig.6 Isobolograms of inhibition interaction between JYC and XXT against α-glucosidase
通过体外α-葡萄糖苷酶活性筛选的方法，得到垫状卷柏和夏枯草不同提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中垫状卷柏植物95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物和夏枯草水提物的大孔树脂70%乙醇洗脱物的抑制作用最强，分别为垫状卷柏和夏枯草的高活性部位，IC值分别为8.17 μg/mL和2.05 μg/mL，均远低于阳性对照阿卡波糖。说明两者具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。通过Lineweaver-Burk双倒数曲线作图法探讨垫状卷柏和夏枯草高活性部位对α-葡萄糖苷酶的竞争抑制作用类型，结果表明，随着垫状卷柏和夏枯草高活性部位浓度的增加，减小，米氏常数()增大，表现为混合I型竞争抑制。说明垫状卷柏和夏枯草高活性部位同时与结合酶(ES)及游离酶(E)结合，且抑制常数>。竞争性抑制作用强于反竞争性抑制作用，垫状卷柏和夏枯草高活性部位对游离酶的抑制作用强于其对酶—底物复合物的抑制作用。该结论与黄晓冬等研究海藻铁钉菜对α-葡萄糖苷酶抑制类型相一致。垫状卷柏和夏枯草可作为筛选有效降糖药物的研究对象，有望从中分离得到安全有效的天然来源α-葡萄糖苷酶抑制剂。
垫状卷柏和夏枯草高活性部位联用时的SFIC值小于或等于1.0，得到的等效剂量分析图呈凹形，表明两者联用时抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用大于两种提取物作用的简单叠加，具有协同增效作用。首次发现当垫状卷柏和夏枯草高活性部位按1∶3组合时，α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，为最佳组合。不同药用植物提取物活性部位联合用药为糖尿病的预防或治疗提供新的思路。
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