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江天铎，程欣欣，徐哲龙
（天津医科大学基础医学院病理生理学教研室，天津 300070）
肝脏缺血再灌注损伤常见于肝脏外科手术过程中，如肝移植、肝切除等。肝脏缺血再灌注损伤是缺血肝组织在恢复血液供应后，肝损伤反而进一步加重的现象，会引起一系列生理生化改变，包括炎症、氧化应激、内质网应激和细胞凋亡等[1-3]，但其具体发病和保护机制尚不清楚。
锌是维持人体正常生理功能所必需的微量元素，在人体内参与300 余种酶的活化以及1 000 余种转录因子三维结构的稳定。研究表明，维持锌离子的稳态有助于减轻肾、胃、肝、心等器官缺血再灌注损伤[4]。细胞锌离子的稳态受离子通道、金属硫蛋白及锌转运体的严格调控[5-6]。ZIP13 作为锌转运蛋白家族成员之一，在调控锌离子稳态中起到重要的作用，它主要定位于高尔基体、内质网和其他细胞器内[7-8]。本研究组最新的研究结果证明，ZIP13 在小鼠心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用[9]，但ZIP13 在肝脏缺血再灌注损伤中的作用还尚不清楚。因此，本研究的目的是探讨ZIP13 在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及其机制。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 C57BL/6J 野生型雄性小鼠由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供[动物批号：SYXK-20190004，许可证号SCXK（京）2019-0010]。ZIP13 flox（ZIP13fl/fl）小鼠由南京大学-南京生物医药研究院提供。Alb-Cre 小鼠为常永生教授赠送。所有小鼠均在SPF 级动物房饲养繁殖。动物实验方案获得天津医科大学实验动物伦理委员会批准，并严格按照国家实验动物管理及使用指南操作。
选取8 周龄雄性ZIP13fl/fl和ZIP13LKO小鼠，采用随机数字表法将24 只小鼠分组如下：（1）假手术组（ZIP13fl/fl-Sham 组）、缺血1 h 再灌注12 h 组（ZIP13fl/fl+I1R12 组）和肝脏ZIP13 基因特异性敲除缺血1 h 再灌注12 h 组（ZIP13LKO+I1R12 组），每组小鼠各4 只。（2）ZIP13fl/fl-Sham 组、缺血1 h 再灌注24 h 组（ZIP13fl/fl+I1R24 组）和肝脏ZIP13 基因特异性敲除缺血1 h 再灌注24 h 组（ZIP13LKO+I1R24 组），每组小鼠各4 只。选取8 周龄雄性腺相关病毒（AAV）感染小鼠，采用随机数字表法将24 只小鼠分组如下：（1）空载体感染假手术组（Vector-Sham 组）、空载体感染缺血1 h 再灌注12 h 组（Vector+I1R12 组）、ZIP13过表达载体感染缺血1 h 再灌注12 h 组（ZIP13OE+I1R12 组），每组小鼠各4 只。（2）Vector-Sham 组、空载体感染缺血1 h 再灌注24 h 组（Vector+I1R24组）、ZIP13 过表达载体感染缺血1 h 再灌注24 h 组（ZIP13OE+I1R24 组），每组小鼠各4 只。
1.1.2 实验试剂 丙氨酸氨基转移酶（ALT）和门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；
TUNEL 凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；
Caspase 9 抗体（10380-1-AP）、Caspase 3 抗体（19677-1-AP）、GRP78 抗体（11587-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；
CHOP抗体（2895S）、抗-GAPDH 抗体（2118S）、Anti-rabbit IgG 抗体（7074S）均购自美国Cell Signaling Technology 公司；
BCL-2 抗体（Sc-492）购自美国Santa Cruz 公司；
Anti Mouse IgG 抗体（RS0001）购自美国ImmunoWay Biotechnology 公司；
AAV 购自上海汉恒生物科技有限公司；
改良苏木素染色液购自北京雷根生物技术有限公司；
伊红染色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 肝脏特异性敲除ZIP13 转基因小鼠的构建 首先将ZIP13fl/fl小鼠和Alb-Cre 小鼠杂交获得F1 代，基因型为ZIP13fl/wt/Alb-Cre。F1 代小鼠成年后继续与ZIP13 flox 小鼠杂交，通过提取鼠尾基因组进行基因型鉴定，即可得肝脏特异性表达Cre 的ZIP13 flox纯合小鼠，基因型为ZIP13fl/fl/Alb-Cre（ZIP13LKO）。
1.2.2 肝脏特异性过表达ZIP13 转基因小鼠的构建 将24 只4 周龄C57BL/6J 野生型雄性小鼠按照随机数字表法根据1.1.1 实验动物安排进行分组，通过尾静脉向相应分组小鼠分别注射ZIP13 过表达腺病毒载体（ZIP13OE）和对照空载体（Vector），注射剂量为100 μL/只，4 周后取小鼠肝脏，通过Western 印迹检测ZIP13 蛋白表达水平并进行后续实验。
1.2.3 小鼠肝脏缺血再灌注模型的建立 按照1.1.1实验动物分组，对相应动物建立缺血再灌注模型。动物术前12 h 禁食，不禁水。经2.5%三溴乙醇腹腔麻醉，腹部至剑突区剃毛，75%乙醇术区消毒，取上腹正中切口并迅速打开腹腔。充分暴露第一肝门，小心分离出肝左叶和肝中叶，并游离出门静脉和肝动脉，用显微血管夹夹闭，使得肝左叶和肝中叶缺血，以实现70%的肝组织缺血。临时关腹，并用动物体温维持仪对小鼠体温进行监控，保持小鼠体温恒定。小鼠肝脏均接受1 h 缺血，根据不同分组需要分别再灌注12 h 或者24 h。假手术组仅开腹、游离血管及关腹等操作，不进行脉管夹闭。
1.2.4 小鼠肝功能测定 肝脏缺血再灌注后12 h处死小鼠，其中包括以下分组：（1）ZIP13fl/fl-Sham组、ZIP13fl/fl+I1R12 组、ZIP13LKO+I1R12 组，每组小鼠各4 只。（2）Vector-Sham 组、Vector+I1R12 组、ZIP13OE+I1R12 组，每组小鼠各4 只。采用心脏穿刺法收集血液，4℃静置过夜，2 000×g 离心20 min，取血清，按照试剂盒说明书检测ALT 和AST 含量。
1.2.5 肝脏组织病理学检测 肝脏缺血再灌注后24 h 处死小鼠，其中包括以下分组：（1）ZIP13fl/fl-Sham组、ZIP13fl/fl+I1R24 组、ZIP13LKO+I1R24 组，每组小鼠各4 只。（2）Vector-Sham 组、Vector+I1R24 组、ZIP13OE+I1R24 组，每组小鼠各4 只。肝组织经4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后进行组织切片，HE 染色，中性树胶封片，显微镜下观察组织病理学改变。
1.2.6 肝脏组织锌含量的测定 取适量肝组织，真空干燥箱干燥2 h 后称重，剪碎后加入浓硝酸，120℃硝解1 h，13%硝酸定容至3 mL。配置标准Blank 液及含Zn2+标准品溶液，建立Zn2+浓度标准曲线。使用ICP-OES 在206.2 nm 波长对Zn2+浓度进行测量。
1.2.7 TUNEL 法染色检测肝细胞凋亡 将石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，滴加20 μg/mL 不含DNase 的蛋白酶K，37℃孵育20 min 进行抗原修复。PBS 洗涤3 次，加入TUNEL 检测液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗涤3 次，荧光显微镜观察肝细胞凋亡。
1.2.8 Western 印迹检测肝脏相关蛋白表达 取小鼠肝组织，在冰上剪成小块，加入RIPA 裂解液（裂解液：PMSF=100：1）充分研磨，冰上静置30 min，12 000×g，4℃离心15 min。取上清液用BCA 法测定蛋白浓度。蛋白经变性后，配制12%分离胶和5%浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶内的蛋白转移至PVDF 膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用TBST 洗涤3 次，每次10 min。一抗GAPDH（1∶2 000）、Caspase 9（1∶1 000）、Caspase3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、CHOP（1∶500）、GRP78（1∶5 000）4℃孵育过夜。第二天用TBST 洗涤3 次，每次10 min。二抗Anti-rabbit IgG（1∶2 000）Anti Mouse IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST 洗涤3 次，每次10 min。化学发光液显色曝光，用Image J 软件分析，其中以GAPDH 为内参，以目的蛋白与内参的灰度值比值反应目的蛋白的表达水平。
2.1 肝脏特异性ZIP13 基因敲除（ZIP13LKO）小鼠和过表达（ZIP13OE）小鼠的鉴定 分别提取8 周龄ZIP13fl/fl、ZIP13LKO、Vector 和ZIP13OE小鼠肝脏组织蛋白，检测ZIP13 蛋白表达，如图1 所示，与ZIP13fl/fl小鼠相比，ZIP13LKO小鼠肝脏中ZIP13 表达明显下降（t=6.26，P＜0.01）；
与Vector 小鼠相比，ZIP13OE小鼠肝脏ZIP13 蛋白表达明显增加（t=4.17，P＜0.05）。
图1 Western 印迹检测ZIP13 蛋白在ZIP13LKO 和ZIP13OE 小鼠肝脏中的表达Fig 1 Expressions of ZIP13 protein in ZIP13LKO and ZIP13OE mice detected by Western blotting analysis
2.2 ZIP13 对小鼠肝功能的影响 与ZIP13fl/fl-Sham 组相比，ZIP13fl/fl+I1R12 组血清ALT、AST 水平显著升高（t=11.43、13.70，均P＜0.001）；
与ZIP13fl/fl+I1R12 组相比，ZIP13LKO+I1R12 组血清ALT、AST 水平显著升高（t=2.95、3.20，均P＜0.05）（表1）。而与Vector+I1R12 组相比，ZIP13OE+I1R12 组血清ALT、AST 水平明显下降（t=3.69、4.26，均P＜0.05）（表2）。
表1 各组小鼠ALT 和AST 活性的比较（）Tab 1 Comparison of ALT and AST activities in mice among various groups（）
表1 各组小鼠ALT 和AST 活性的比较（）Tab 1 Comparison of ALT and AST activities in mice among various groups（）
注：除Sham 组，其余小鼠均做肝脏缺血1 h 再灌注12 h（I1R12）处理；
与ZIP13fl/fl-Sham 组相比，aP＜0.001；
与ZIP13fl/fl+I1R12 组相比，bP＜0.05；
ALT：丙氨酸氨基转移酶；
AST：门冬氨酸氨基转移酶
表2 注射相应腺相关病毒后，各组小鼠ALT 和AST 活性的比较（）Tab 2 Comparison of ALT and AST activities in mice among various groups after AAV infection（）
表2 注射相应腺相关病毒后，各组小鼠ALT 和AST 活性的比较（）Tab 2 Comparison of ALT and AST activities in mice among various groups after AAV infection（）
注：除Sham 组，其余小鼠均做肝脏缺血1 h 再灌注12 h（I1R12）处理；
与Vector-Sham 组相比，aP＜0.001；
与Vector+I1R12 组相比，bP＜0.05；
ALT：丙氨酸氨基转移酶；
AST：门冬氨酸氨基转移酶
2.3 ZIP13 对小鼠肝脏形态学的影响 光镜下观察发现，ZIP13fl/fl-Sham 组肝索排列整齐，肝细胞形态正常，胞质染色均匀，核完整，肝窦无明显扩展、淤血、炎细胞浸润等病理改变（图2A）。与ZIP13fl/fl-Sham 组相比，ZIP13fl/fl+I1R24 组肝脏肝索结构紊乱，细胞明显水肿形成空泡结构，肝血窦受挤压，有炎性细胞聚集、肝细胞坏死等病理改变（图2A、2B）。与ZIP13fl/fl+I1R24 组相比，ZIP13LKO+I1R24 组肝细胞水肿更明显，肝淤血更严重、肝细胞坏死更严重（图2B、2C）。与Vector+I1R24 组相比，ZIP13OE+I1R24 组肝细胞水肿减轻，肝细胞坏死减轻，淤血与炎细胞浸润等病理改变减轻（图2E、2F）。
图2 HE 染色在显微镜下观察肝脏病理结构（400×）Fig 2 HE staining was used to observe the pathological structure of liver under microscope（400×）
2.4 ZIP13 对小鼠肝细胞内锌水平的影响 在肝脏缺血再灌注时，与ZIP13fl/fl-Sham 组相比，ZIP13fl/fl+I1R24 组肝组织内锌水平明显降低（t=13.49，P＜0.001）；
与ZIP13fl/fl+I1R24 组相比，ZIP13LKO+I1R24 组肝组织锌含量进一步降低（t=3.29，P＜0.05）（图3A）。与Vector+I1R24 组相比，ZIP13OE+I1R24 组肝组织锌含量明显上升（t=3.88，P＜0.05）（图3B）。
图3 ICP-OES 法测定肝脏Zn2+水平Fig 3 Liver Zn2+levels measured by ICP-OES
2.5 ZIP13 对小鼠内质网的影响 Western 印迹显示，肝脏缺血再灌注时，与ZIP13fl/fl-Sham 组相比，ZIP13fl/fl+I1R24 组肝细胞内质网应激相关蛋白CHOP 和GRP78 的表达明显增加（t=4.76、4.54，均P＜0.05）；
与ZIP13fl/fl+I1R24 组相比，ZIP13LKO+I1R24 组CHOP和GRP78 蛋白表达进一步增加（t=2.60、2.98，均P＜0.05）（图4A）；
与Vector+I1R24 组相比，ZIP13OE+I1R24 组CHOP 和GRP78 蛋白表达降低（t=3.47、2.88，均P＜0.05）（图4B）。
图4 Western 印迹检测CHOP 和GRP78 蛋白表达Fig 4 Expression of CHOP and GRP78 detected by Western blotting
2.6 ZIP13 对小鼠肝细胞凋亡的影响 从TUNEL结果上看，与ZIP13fl/fl-Sham 组相比，肝脏缺血再灌注后，肝细胞凋亡明显增加（图5A、5B、5C）；
与ZIP13fl/fl+I1R24 组相比，ZIP13LKO+I1R24 组肝细胞凋亡小体明显增加（图5B、5C）；
与Vector+I1R24 组相比，ZIP13OE+I1R24 组肝细胞凋亡小体减少（图5E、5F）。Western 印迹显示，与ZIP13fl/fl-Sham 组相比，ZIP13fl/fl+I1R24 组肝组织活化形式的凋亡蛋白Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3 表达升高（t=4.56、3.73，均P＜0.05），而未活化的凋亡蛋白Caspase9 和Caspase3以及抗凋亡蛋白Bcl-2 表达量降低（t=4.92、2.8、2.89，均P＜0.05）。与ZIP13fl/fl+I1R24 组相比，ZIP13LKO+I1R24 组活化形式的凋亡蛋白Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3 表达增加（t=3.44、2.49，均P＜0.05），而Caspase9、Caspase3 和Bcl-2 蛋白表达降低（t=2.62、3.43、3.07，均P＜0.05）（图6A）。与Vector+I1R24 组相比，ZIP13OE+I1R24 组活化形式的凋亡蛋白C leaved Caspase9、Cleaved Caspase3 表达降低（t=3.02、2.96，均P＜0.05），而Caspase9、Caspase3 和Bcl-2 蛋白表达升高（t=2.8、3.02、2.64，均P＜0.05）（图6B）。
图5 TUNEL 染色后，共聚焦显微镜下检测凋亡小体（400×）Fig 5 Apoptotic bodies detected by TUNEL staining kit under confocal microscope（400×）
图6 Western 印迹检测肝组织中凋亡蛋白Caspase 3 及裂解形式，Caspase 9 及裂解形式及抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达Fig 6 Apoptosis protein Caspase 3 and its cleaved form，Caspase 9 and its cleaved form and anti-apoptotic protein Bcl-2 detected in whole liver tissue lysates by Western blotting
肝脏缺血再灌注损伤的发生机制十分复杂，与酸中毒、肝细胞钙超载、氧自由基产生过多、Kupffer细胞与中性粒细胞浸润及细胞因子等密切相关[10-11]。肝脏缺血再灌注损伤可严重损害肝功能，甚至产生不可逆的损害，从而导致多器官功能障碍的级联反应[2]。在肝脏移植、肝癌切除等手术中，预防并减轻肝脏缺血再灌注损伤，是肝功能恢复和提高手术质量的关键[3]。
锌离子可通过多种途径调节相关炎症信号转导起到抗炎、抗氧化应激的作用[12]。研究表明，外源给予锌能够通过多种机制减轻肝脏缺血再灌注损伤[13-15]。本研究结果首次证实了肝脏缺血再灌注时，肝细胞内锌水平显著降低，这可能是肝脏缺血再灌注损伤的机制之一。近年来，锌转运蛋白在I/R 中的作用已成为国内外研究的热点。哺乳动物细胞中锌离子稳态主要由两个锌转运蛋白家族来维持，即SLC39A（solute-linked carrier 39A，SCL39A）和SLC30A（solute-linked carrier 30A，SLC30A）。SLC39A 家族又称ZIP（Zrt-and-Irt-like proteins）家族，其功能是将锌离子从细胞外或细胞器内转运到细胞质中，以增加胞浆锌离子浓度，而SLC30A 家族的主要作用是将锌离子从细胞质转移到细胞器内和细胞外，以降低细胞浆锌离子浓度[16-17]。ZIP13 是SLC93A 成员之一，位于高尔基体、内质网等细胞器内。Bin 等[18]证明，ZIP13 基因突变通过含缬氨酸蛋白连接的泛素-蛋白酶体途径加速蛋白质降解，降低功能蛋白水平，引起细胞内锌稳态紊乱，导致脊椎软骨发育性Ehlers-Danlos 综合征（SCD-EDS）。研究表明，ZIP13 通过减少CCAAT 增强子结合蛋白β 蛋白在抑制脂肪细胞褐变中起关键作用[19]。然而ZIP13 在肝脏缺血再灌注损伤中的具体作用还不清楚。本研究发现，ZIP13的敲除导致肝细胞内锌水平降低，肝脏缺血再灌注损伤加重，而过表达ZIP13 则会升高肝细胞内锌水平，减轻缺血再灌注损伤。这些结果提示ZIP13 是肝细胞内起主要作用的锌转运蛋白，能够通过维持肝细胞锌稳态保护肝脏。
肝细胞代谢活跃，含有丰富的内质网结构，内质网是真核细胞修饰和分泌蛋白的重要场所，参与钙稳态、蛋白质折叠和脂质生物合成等[20]。当肝细胞缺血缺氧再灌注后，会导致大量未折叠蛋白质或错误折叠的蛋白质聚集在内质网，引起内质网应激[21]。适度的内质网应激可通过抑制蛋白质合成而促进错误折叠蛋白质降解起到保护作用，这一过程称为未折叠蛋白反应（UPR），而持续过强的内质网应激则会超过UPR 能力，引起细胞凋亡，进而引起严重的肝损伤[22-23]。内质网应激标志性蛋白是GRP78 和CHOP 蛋白，GRP78 是一种分子伴侣热休克蛋白，是正常细胞内质网中UPR 的主体。当内质网应激发生时，GRP78 活性增强，它与错误折叠的蛋白质或未折叠的蛋白质结合成复合物，以促使其恢复正常结构，并维持内质网稳态[24]。CHOP 蛋白在细胞凋亡、自噬中起重要作用[25]。CHOP 蛋白是内质网应激时启动细胞凋亡的标志性蛋白。内质网应激时，CHOP蛋白的高表达可通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 而诱导细胞凋亡[26]。本研究发现，肝脏缺血再灌注时，肝细胞GRP78 和CHOP 蛋白明显升高，内质网应激明显加重。ZIP13 敲除会进一步加重内质网应激；
而过表达ZIP13 则减轻内质网应激。这些结果提示，ZIP13可能通过参与调控内质网应激，从而在肝脏缺血再灌注中发挥重要作用。
细胞凋亡是肝缺血再灌注过程中的病理生理特征之一。半胱天冬酶家族是凋亡的关键介质。其中Caspase3 是细胞凋亡的典型标志物，活化的Caspase3 在凋亡细胞的染色质凝聚和DNA 断裂中起到关键作用。因此Caspase3 在凋亡小体形成的过程中是必不可少的。Caspase9 是Caspase3 的上游调控蛋白，活化的Caspase9 能激活Caspase3，从而启动细胞凋亡[27-28]。本研究结果表明，肝脏缺血再灌注时，ZIP13 的敲除能够促进肝细胞凋亡，造成严重的肝损伤；
而过表达ZIP13 则可降低肝细胞凋亡，减轻肝损伤。这些结果提示，ZIP13 还可通过调控细胞凋亡参与肝脏缺血再灌注损伤。
综上所述，本研究首次证实了肝脏缺血再灌注时，肝细胞内锌水平显著降低可能是缺血再灌注损伤的机制之一。并且在此基础上，笔者首次证实锌转运体ZIP13 能够通过维持肝细胞锌稳态来调控内质网应激和细胞凋亡，从而发挥肝脏保护作用。
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