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崔 悦，张葆祺，李乐乐，林晓影，冯 波，关 皎，朱鹤云
(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)
栀子为茜草科植物，其主要药物部位是干燥成熟果实，能够凉血解毒[1]。据文献报道，栀子具有多种药理活性，如：抗氧化、抗炎、降压、保肝、降血糖、抗动脉粥样硬化、神经保护、抗抑郁、抗肿瘤等[2-7]。栀子中的化学成分众多，主要包括环烯醚萜苷类、有机酸类、木脂素类、单萜苷类、三萜类等[8-11]。环烯醚萜苷类为栀子的主要活性成分，本试验选择的4个测定指标(京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯和京尼平苷酸)属于环烯醚萜苷类，绿原酸属于有机酸类。研究表明，京尼平苷能够治疗非酒精性脂肪性肝病[12]、保护老年大鼠软骨细胞[13]。京尼平1-β-D-龙胆双糖苷具有抗心力衰竭[14]、减少黑色素形成和减轻细胞毒性[15]等作用。京尼平苷酸具有良好的抗炎作用[16]。去乙酰车叶草苷酸甲酯具有较好的镇痛作用[17]。绿原酸是一种天然多酚，可以通过调节肠道健康进而降低仔猪腹泻率[18]，此外，还具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[19]。
目前，栀子中有效成分的含量测定方法多采用高效液相色谱法[20-22]，其测定成分相对较少且灵敏度低、分析时间较长。本试验采用的超快速液相色谱-质谱联用(UFLC-MS/MS)技术是将超快速液相色谱和质谱有机结合的一项新型联用技术，同时具备优越的色谱分离能力和质谱检测能力。与高效液相色谱相比，本试验采用的超快速液相色谱分离速度更快、灵敏度更高、分离度更好，可大大缩短分析时间，提高分离效果，节省溶剂用量，降低分析成本；
另外，本试验所采用的质谱为四极杆线性离子阱质谱仪，具有良好的定性、定量能力，能够实现对微量分析物的精准定量[20-22]。本试验建立了栀子中5种有效成分的定量分析方法，并测定了其在栀子药材中的含量，可为栀子在兽医兽药领域的研究与开发提供参考依据。
1.1 主要仪器 超高快速液相色谱仪(型号：Prominence UFLC，日本岛津公司。仪器配置包括：自动进样器，型号：Prominence SIL-20AHT；
二元高压泵，型号：LC-20AD；
柱温箱，型号：CTO-20A；
紫外检测器，型号：SPD-20A；
色谱工作站，型号：LC solution)，三重四极杆质谱仪(型号：3200 QTRAP，美国AB Sciex公司)，微型高速万能试样粉碎机(型号：FW80，天津泰斯特公司)，十万分之一电子天平(型号：CPA 225D，德国Sartorius公司)，数控声波清洗器(型号：KQ-250DE，昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 主要试剂 本试验所使用的对照品包括京尼平苷(批号：19101705)、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷(批号：16120502)、去乙酰车叶草苷酸甲酯(批号：17101701)、京尼平苷酸(批号：19101604)、绿原酸(批号：20121117)，均购自成都普菲德公司，纯度均大于98%；
乙腈(LC-MS级)，购自美国Fisher公司；
甲酸(LC-MS级)，购自国药集团化学试剂有限公司；
水为屈臣氏纯净水；
栀子药材(产地：江西省)，购自吉林市吉林大药房，经鉴定为栀子道地药材。
1.3 分析条件
1.3.1 色谱条件 色谱柱：Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)；
流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；
洗脱方式：梯度洗脱(0～7.0 min,10%～25% B)；
流速：0.4 mL/min；
柱温：35 ℃；
平衡时间：5 min；
进样体积：5 μL。
1.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子(Electrospray ion,ESI)源，负离子和多反应监测(Multiple response monitoring,MRM)模式，源喷雾电压-4 500 V，雾化气、辅助气和气帘气压力分别为50、50 psi 和20 psi。京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸的MRM参数见表1。
表1 京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸的MRM参数
1.4 溶液的制备
1.4.1 对照品溶液 取京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸对照品适量，精密称定，分别置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成质量浓度分别为1.0、0.2、0.1、0.1 mg/mL和0.1 mg/mL的储备液。
1.4.2 供试品溶液 称得栀子粉末0.5 g于50 mL锥形瓶中，加甲醇-水(50∶50，v/v)溶液25 mL，超声30 min，放冷，滤过。精密量取续滤液0.5 mL，经 0.22 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。
1.5 方法学考察
1.5.1 线性关系及检测限、定量限 分别精密量取“1.4.1”项下的各对照品储备液适量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇-水(50∶50，v/v)溶液稀释至刻度，摇匀，得到京尼平苷浓度分别为 5、10、20、50、100 μg/mL和200 μg/mL，京尼平1-β-D-龙胆双糖苷浓度分别为 1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg/mL和40.0 μg/mL，去乙酰车叶草苷酸甲酯浓度分别为 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL，京尼平苷酸的浓度为 0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL，绿原酸浓度分别为 0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL的系列混合对照品溶液。以对照品的浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并计算各成分的回归方程和相关系数。将京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸对照品稀释后进样，考察其检测限(信噪比S/N=3)和定量限(信噪比S/N=10)。
1.5.2 精密度试验 取混合对照品溶液200 μL，各成分浓度为京尼平苷50 μg/mL，京尼平1-β-D-龙胆双糖苷10.0 μg/mL，去乙酰车叶草苷酸甲酯5.0 μg/mL，京尼平苷酸1.0 μg/mL，绿原酸1.0 μg/mL。连续进样6 次，并计算各待测成分峰面积的相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)。
1.5.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液200 μL，分别于0、2、4、8、12 h和24 h，按“1.3”项中色谱和质谱条件进样分析，计算各待测成分峰面积的RSD。
1.5.4 重复性试验 取同一批次栀子样品，共6 份，按“1.4.2”项方法制备供试品溶液，按“1.3”项中色谱和质谱条件进样分析，计算各待测成分峰面积的RSD和含量。
1.5.5 加样回收率试验 取同一批次已知含量的栀子样品9份，每份0.25 g，精密称定，加入对照品京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸的量相当于栀子样品中各对照品含量的80%、100%和120%，各3份。按“1.4.2”项中操作方法，制备供试品溶液并进样分析，计算各待测成分的回收率和RSD。
1.6 样品含量测定 取6批栀子样品，按“1.4.2”项方法制备供试品溶液，按“1.3”项中色谱和质谱条件进样分析，测定峰面积，计算栀子中各成分的含量。
2.1 质谱与色谱图 京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸的产物离子扫描质谱图见图1，混合对照品和栀子样品的MRM色谱图见图2。
图1 京尼平苷(A)、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷(B)、去乙酰车叶草苷酸甲酯(C)、京尼平苷酸(D)和绿原酸(E)的产物离子扫描质谱图
图2 混合对照品(A)和栀子样品(B)的MRM色谱图
2.2 方法学考察
2.2.1 线性关系及检测限、定量限 5种有效成分的线性回归方程见表2。京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸分别在5～200 μg/mL、1.0～40.0 μg/mL、0.5～20.0 μg/mL、0.1～4.0 μg/mL和 0.1～4.0 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。京尼平苷的检测限和定量限分别为20 ng/mL和67 ng/mL，京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的检测限和定量限分别为10 ng/mL和33 ng/mL，去乙酰车叶草苷酸甲酯的检测限和定量限分别为10 ng/mL和33 ng/mL，京尼平苷酸的检测限和定量限分别为5 ng/mL和17 ng/mL，绿原酸的检测限和定量限分别为3 ng/mL和10 ng/mL。
表2 京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸的线性回归方程
2.2.2 精密度试验 各待测成分峰面积的RSD值：京尼平苷为1.1%、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷为2.7%、去乙酰车叶草苷酸甲酯为1.6%、京尼平苷酸为2.2%、绿原酸为1.7%，说明仪器精密度良好。
2.2.3 稳定性试验 各待测成分峰面积的RSD值：京尼平苷为0.9%、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷为1.5%、去乙酰车叶草苷酸甲酯为2.3%、京尼平苷酸为2.6%、绿原酸为2.3%，表明24 h内供试品溶液具有良好的稳定性。
2.2.4 重复性试验 各待测成分含量平均值和峰面积的RSD值：京尼平苷为5.04%(RSD=1.8%)、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷为0.839%(RSD=1.7%)、去乙酰车叶草苷酸甲酯为0.044 7%(RSD=2.6%)、京尼平苷酸为0.009 91%(RSD=2.4%)、绿原酸为0.024 4%(RSD=2.0%)，表明该方法重复性良好。
2.2.5 加样回收率试验 各待测成分的回收率和RSD结果见表3。
表3 京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸的回收率
2.3 样品含量测定 结果见表4。
表4 6批栀子样品中京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸的含量
3.1 色谱和质谱条件的优化 本试验采用反相高效色谱系统对栀子中的5种有效成分同时进行含量测定，在反相高效色谱中常用的有机相为甲醇和乙腈，故试验中比较了这2种溶剂作为有机相时的分离效果。采用水-甲醇或水-乙腈作为流动相时，分离效果不佳，色谱峰较宽且有一定程度拖尾。本试验考察了0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)和 0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)作为流动相的分离效果，0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)作为流动相具有更好的分离效果。分离复杂混合物时，采用梯度洗脱的方式能够获得较好的的分离效果，并能够缩短分析时间。通过不断反复调整洗脱程序发现过短的分析时间无法成功分离京尼平苷，最终确定的梯度洗脱条件为：0～7.0 min，10%～25% 乙腈，分析时间仅为7 min。
5种待测物均采用电喷雾离子源(ESI)进行分析，负离子模式下的响应高于正离子，因此采用负离子模式进行检测。京尼平苷主要形成m/z433.1的[M+HCOO]-加合离子，京尼平1-β-D龙胆双糖苷主要形成m/z595.0的[M+HCOO]-加合离子，去乙酰车叶草苷酸甲酯主要形成m/z449.1的[M+HCOO]-加合离子，京尼平苷酸主要形成m/z373.1的[M-H]-加合离子，绿原酸主要形成m/z353.1的[M-H]-加合离子，以上离子灵敏度高、信号较稳定。
碰撞能(Collision,energy,CE)影响定量结果，故需对CE进行优化。CE较低，在 10～30 eV范围内时，碎片离子少且稳定；
CE 较高，在30～50 eV范围内时，母离子信号响应较差，形成的碎片离子很多。最终确定京尼平苷、京尼平1-β-D龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸的CE值分别为-23、-30、-24、-30 eV和-28 eV，在此碰撞能下获得的质谱响应良好且稳定。
3.2 提取溶剂的选择 考察不同提取溶剂(纯水、100%乙醇溶液，100%甲醇溶液和50%甲醇溶液)的提取效果，结果发现：采用50%甲醇溶液提取效率最高，此时京尼平苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、京尼平苷酸和绿原酸的提取率分别为5.16%、0.799%、0.041 5%、0.008 46%和0.024 9%，最终确定50%甲醇溶液为提取溶剂。
3.3 各待测物含量比较 本试验测定6批栀子中上述5种有效成分的含量，结果表明，6批栀子的含量均符合《中国药典》2020年版的规定(含栀子苷不少于1.8%，京尼平苷又名栀子苷)。栀子药材中上述5种活性成分的含量由高到低依次为：京尼平苷>京尼平1-β-D-龙胆双糖苷>去乙酰车叶草苷酸甲酯>绿原酸>京尼平苷酸。含量最高的京尼平苷是栀子中重要的活性成分，具有抗炎、抗氧化等作用，其在栀子中含量丰富，药理作用强，适合大量提取，可用于对牲畜、家禽及宠物的日常疾病预防与治疗[4,23]。本试验可为相关兽药的开发提供一定质量标准参考。
本试验建立了一种UFLC-MS/MS方法以同时测定栀子中5种有效成分的含量，该方法具有分析速度快、分离效果好、灵敏度高等优点。本试验建立的方法可为中药栀子在兽药领域的应用提供质量标准参考，有助于扩大中药等天然药物在兽药领域的应用范围，为兽药的开发提供新思路。
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