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夏 菲,第五文博,陈 彤，王 乐,王晓玲,徐白璐，谈娜娜
(宝鸡文理学院 化学化工学院,陕西省植物化学重点实验室,陕西 宝鸡 721013)
黄芩(ScutellariaBaicalensisGeorgi.)为多年生草本唇形科黄芩属植物，药用其根，具有清热燥湿、泻火解毒等功效[1]。黄芩中的有效成分主要为黄酮类化合物，包括黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷和汉黄芩苷等[2]。药理活性研究发现其具有抗肿瘤、抗氧化和保护心血管等药理作用[3-5]。
近年来，LC-MS被广泛应用于药用植物黄酮类成分分析。如吴巍等[6]利用HPLC-ESI-MS/MS鉴别了2种互为同分异构体的黄芩黄酮C-苷类化合物，并归纳了其ESI-MSn裂解特征与一般规律。黄晶晶等[7]采用HPLC-ESI-TOF-MS/MS方法，从泽兰水提物中共鉴定到22个化合物，包括黄酮类、甾体类等。COLOMBO et al[8]利用LC-MS/MS方法从甘蔗提取物中鉴定到17种黄酮类成分，其中6-甲氧基藤黄菌素-8-C-阿拉伯糖-7-O-葡萄糖苷等7种为新化合物。BHATT et al[9]利用UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS/MS方法从竹叶花椒叶中分离鉴定到12种活性化合物，包括儿茶素、异牡荆素和橙皮苷等。然而，对于黄芩黄酮的整体化学组成与ESI裂解规律仍有待深入探索。
血清白蛋白负责体内大量内源性和外源性物质的运输，具有重要生理功能[10]，其与天然药物活性成分的结合是目前的研究热点之一。牛血清白蛋白(BSA)因其与人血清白蛋白(HSA)的结构同源性而被广泛应用。近年来，超滤质谱技术被广泛用于活性结合筛选[11]，该技术有效分离活性成分[12]，具有在线筛选能力强、速度快、操作简单、可靠性高等特点[13-14]。
本文旨在对黄芩黄酮进行整体性分析，并筛选其中具有BSA蛋白结合活性的成分。首先通过分析目标成分的ESI-MS质谱碎片裂解途径，并结合精确分子量与紫外光谱吸收特征峰进行鉴定，再利用超滤质谱技术筛选其中的BSA蛋白结合活性成分。本研究可为探索黄芩黄酮与功能性生物大分子的相互作用研究提供科学依据。
1.1 原料、仪器及试药
黄芩根(为炮制)购自宝鸡医药大厦；
牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma-Aldrich公司；
汉黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩素-6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和去甲汉黄芩素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷纯度均在98%以上，购自宝鸡辰光生物科技有限公司；
正己烷(分析纯)、氯仿(分析纯)、正丁醇(分析纯)和乙醇(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司；
AB TripleTOF 4600质谱仪(美国AB SCIEX)；
Shimadzu LC-20ADXR液相色谱仪(日本岛津)；
Cence H1850台式高速离心机(湖南湘仪)；
Milli-Q超纯水处理系统(美国 Millipore)；
Buchi Rotavapor R-100旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；
VORTEX-5恒温混匀仪(浙江纳德科学仪器有限公司)。
1.2 标准品溶液的配制
准确称量标准品，用甲醇溶解，并稀释至5 μg/mL，4 ℃ 保存，备用。
1.3 黄芩黄酮样品的提取
称取100 g黄芩，粉碎，过100目筛。原料依次用正己烷、氯仿和70%乙醇热回流提取2～3 h，然后将70%乙醇提取液用正丁醇(水饱和后)萃取，取上层有机相，旋蒸浓缩至浸膏状，将减压浓缩后的提取物样品用色谱甲醇复溶，浓度为10 μg/mL，过0.22 μm 滤膜，装瓶，4 ℃保存，备用。
1.4 黄芩粗提物中BSA结合活性成分的筛选
参考相关文献[15]，于1.5 mL离心管中分别加入190 μL乙酸铵缓冲液(10 mM，pH 6.86)和2 μL黄芩粗提物(乙酸铵缓冲液，50 mg/mL)，再分别加入8 μL BSA(乙酸铵缓冲液，100 μM)，37 ℃孵育30 min；
将混合液加入2 mL超滤离心管(PES, 10 000 MW)中，10 000 g离心10 min，弃掉滤液；
乙酸铵缓冲液(pH 6.86)洗涤3次；
加入200 μL CH3OH-H2O(1∶1,v/v, pH 3.30)，10 000 g离心15 min，重复3次，收集滤液。另设置对照组，不加BSA，其他条件相同；
滤液过0.22 μm膜，保存待分析。
1.5 LC-MS分析
色谱条件：色谱柱：Shim-pack XR-ODS (100 mm×2.0 mm, 2.2 μm)；
流动相：A：水-0.1%甲酸、B：甲醇-0.1%甲酸；
洗脱梯度：0 min，10%甲醇；
8 min，48%甲醇；
14 min，48%甲醇；
20 min，100%甲醇；
25 min，100%甲醇；
流速：0.3 mL/min；
柱温：40 ℃；
检测波长：280 nm。
质谱条件：电离模式：ESI正离子模式；
去簇电压(DP)：100 V；
喷雾电压(IS)：5 500 V (+)、离子化温度：550 ℃；
雾化气(GS1)：55 psi；
辅助气(GS2)：55 psi；
气帘气(Curtain Gas)：30 psi；
扫描范围220～800m/z，全扫描模式；
碰撞能量：MS110 eV,MS250 eV；
数据采集及处理软件使用Analyst 1.7和PeakView 2.0。
1.6 成分鉴定
使用UPLC-Q-TOF-MS分析标准品及样品，归纳目标成分在ESI源下的质谱碎片裂解规律；
根据精确分子量误差比对、质谱碎片裂解路径归属，并结合文献报道的紫外光谱特征吸收峰，对目标成分进行鉴定。
2.1 黄芩黄酮的LC-MS/MS分析
利用UPLC-TripleTOF-MS/MS分析了黄芩黄酮提取物，在5×10-6的质量误差范围内共鉴定出33种黄酮类成分，包括21种苷元和12种黄酮苷类成分，总离子流图见图1，主要色谱峰分离良好，具体的成分鉴定信息见表1。
表1 黄芩正丁醇萃取物中黄酮类成分的UPLC-TripleTOF MS/MS分析结果Tab. 1 Characterization of flavonoids from Radix Scutellariae n-butanol extracts by UPLC-TripleTOF-MS/MS
图1 黄芩黄酮提取物的UPLC-TripleTOF MS检测总离子流图(TIC)Fig. 1 Total ions chromatogram (TIC) of the flavonoids extract from Radix Scutellariae by UPLC-TripleTOF MS
续表1
2.2 黄芩黄酮各成分的ESI裂解途径规律
首先，通过与标准品的特征碎片离子比对，9个化合物得到确认，包括汉黄芩素、黄芩新素、汉黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、黄芩苷和黄芩素-6-O-β-葡萄糖醛酸苷。在此基础上，通过分析ESI源下质谱碎片裂解规律进一步推断，并结合文献报道进行确认。
化合物1-5均属于仅有羟基取代的黄酮苷元类物质。化合物1的准分子离子峰为m/z=255.065 2，与白杨素的[M+H]+精确分子量比对误差为-0.8×10-6，推测其主要的二级碎片离子m/z=153.019 2和103.054 7主要来源于RDA 1/3断裂产生的[1,3A+]和[1,3B+]离子，预示分子中A环有2个-OH取代基，而B环无取代基，与白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷标准品的苷元裂解一致。同时，HPLC检测其最大紫外吸收波长为212，267和313 nm，与文献报道一致[16]。因此，推测化合物1为白杨素，裂解路径如图2所示。同样，化合物2-4被分别鉴定为2",5,6",7-四羟基黄酮、二氢黄芩素和2",3,5,6",7-五羟基黄酮。
图2 白杨素的ESI-MS裂解路径分析Fig. 2 Analysis of the primary fragmentation pathways of chrysin in ESI-MS
化合物6-21属于甲氧基取代的黄酮苷元，失去1～n个CH3自由基是这类化合物的显著特点。比如，化合物8在一级全扫描模式中显示质子化分子离子m/z=301.070 7，它失去一个CH3自由基后产生碎片离子m/z=286.045 6，该离子经RDA反应分别产生[1,3A+]m/z=168.005 0和[1,4A+]m/z=140.009 6，表明化合物A环含有2个-OH和1个-OCH3取代基；
此外，准分子离子经RDA 0/2断裂也可以生成碎片[0,2B+]m/z=121.028 9，推测该化合物B环上有邻位羟基取代。因此，化合物8被鉴定为5,8,2"-三羟基-7-甲氧基黄酮，裂解路径如图3所示。同时，其UVλmax为275和386 nm，符合黄酮类化合物的特征吸收[17]。
化合物11的 [M+H]+为m/z=285.075 8，其MS2谱图中有碎片离子[M+H-30]+m/z=270.052 0，推测为丢失1个CH3自由基的结果，并且该离子再经丢失中性分子H2O，CO2及CHO后生成m/z=252.042 0和m/z=179.046 2的碎片离子；
其次，离子 [M+H-28]+m/z=241.049 4为失去一分子CO所得；
此外，诊断性离子[1,3A+]m/z=168.004 8和[1,3B+]m/z=103.052 3预示该化合物A环上有2个-OH和1个-OCH3取代基，B环上无取代基，同时，碎片离子[1,3A+-CH3-OH]m/z=151.055 3的存在表明了OCH3取代在8位。因此，化合物11被推断为汉黄芩素，裂解路径见图4。同时，其UVλmax为216和275 nm，符合黄酮类化合物的特征吸收。
图4 汉黄芩素的ESI-MS裂解路径分析Fig. 4 Analysis of the primary fragmentation pathways of wogonin in ESI-MS
图3 5,8,2"-三羟基-7-甲氧基黄酮的ESI-MS裂解路径分析Fig. 3 Analysis of the primary fragmentation pathways of 5,8,2"-trihydroxy-7-methoxyflavone in ESI-MS
图5 5,6,7-三羟基-8-甲氧基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的ESI-MS裂解路径分析Fig. 5 Analysis of the primary fragmentation pathways of 5,6,7-trihydroxy-8-methoxyflavone-7-O-β-D-glucuronopyranoside in ESI-MS
图6 5,7,2" -三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的ESI-MS主要碎片裂解路径分析Fig. 6 Analysis of the primary fragmentation pathways of 5,7,2"-trihydroxy-6-methoxyflavone-7-O-β-D-glucuronopyranoside in ESI-MS
2.3 黄芩黄酮中的BSA结合活性成分
由于天然产物成分复杂，化合物之间存在相互作用，血清白蛋白是血液循环系统中最丰富的蛋白质，在多种外源性化合物的运输和沉积中起着重要的作用。许多药物吸收后会进入循环系统，并与血清白蛋白发生较强的和可逆的结合，影响药物的生物活性和毒性，因此，药物的吸收、分布、代谢和排泄特性以及它们的稳定性和毒性可能会因为它们与血清白蛋白的结合而受到显著影响，同时可能诱发血清白蛋白的构象变化，从而影响药物的活性。
使用超滤质谱方法对黄芩黄酮提取物进行分析，结果表明，共有17个化合物与BSA存在一定的相互作用，通过分析化合物的保留时间、UV特征以及MS/MS数据并与黄芩化学成分的研究文献对比，可进一步指认化合物的结构，分别为：2",5,6",7-四羟基二氢黄酮醇、2",5,6",7-四羟基二氢黄酮、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖苷等(表1)。
本研究从黄芩中鉴定出33种黄酮类成分，包括21种黄酮苷元与12种黄酮苷类，并对其在ESI-MS/MS下的质谱裂解规律进行了归纳，其中白杨素-7-O-β-D-葡萄糖苷等17种成分显示出BSA蛋白结合活性，是潜在的药物先导化合物，该结果可为黄芩资源深入开发与中药现代化提供理论依据。
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