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童英，段小花，杨丽萍，陈普
(云南中医药大学云南省傣医药与彝医药重点实验室，昆明 650500)
脑梗死又称缺血性脑卒中，指各种原因引起的血管受损、闭塞导致的大脑血氧供应受损甚至中断，局部缺血区域及邻近受累的脑组织出现缺血缺氧性坏死，患者出现瘫痪、失语等相应的神经功能缺损症状的一种急性脑血管疾病，约占急性脑血管疾病的75%，病死率居我国三大高死亡率疾病的首位[1]。脑梗死具有并发症多、病情重、治疗费用高昂、治疗周期长等特点，已成为严重的全球性疾病。近年来，疏通阻塞血管或恢复患病部位血液供应一直是脑梗死的有效治疗方法，但若血流恢复时间超过了再灌注时间窗，反而会加剧脑组织损伤，即发生脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)。再灌注可激活神经元凋亡并导致海马和皮质损伤，进一步恶化病情，引发脑水肿、脑出血等，使致残率和致死率进一步升高，严重威胁脑梗死患者的生存和预后，给社会与家庭带来沉重负担[2]。
脑是一个高能量需求器官，只能通过葡萄糖氧化供能，线粒体既是其产能的重要场所，又是脑组织中最丰富的细胞器，因此线粒体是脑组织能量需求的唯一来源，能量的充足对维持脑功能有重要影响，如释放神经递质[3]。研究证明，线粒体异常会加速CIRI，维持线粒体完整性可以保护神经元细胞，减少CIRI的病理进展[4]。目前，以线粒体为靶点进行脑保护已成为研究的热点，如通过抑制促分裂原活化的蛋白激酶/线粒体凋亡途径，从而在氧糖剥夺/恢复损伤期间促进海马神经元活力[5]。现就CIRI与线粒体凋亡的关系及其靶向研究进行综述，以期为脑梗死的治疗提供新思路。
溶栓治疗并非使所有脑梗死患者获益，部分患者经溶栓治疗后病情反而加重，出现CIRI，影响治疗效果，因此，了解CIRI在脑梗死治疗中至关重要。在脑缺血期间，动脉血流量降低，脑组织缺血、缺氧，腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)合成效率降低，细胞内酸性代谢产物增加，大量活性氧产生，且细胞内Ca2+浓度明显升高。再灌注期间，血液和氧气供应恢复后，脑损伤级联反应被激活，包括线粒体功能障碍及细胞凋亡/坏死、能量障碍、自由基损伤、内质网应激、Ca2+超载、血脑屏障的破坏、炎症反应、一氧化氮毒性、兴奋性氨基酸的毒性作用、基因表达异常等[6-7]，不仅无法恢复已经坏死细胞的功能，还可使受损伤并不严重的组织出现不可逆性坏死。其中，线粒体功能障碍是CIRI的最关键环节[8]，凋亡/坏死是细胞死亡的主要方式[9]，越来越多的科学研究和临床证据分析显示，再灌注后神经元细胞的死亡与线粒体功能障碍引起的凋亡相关[10-13]。
再灌注后机体会启动各种与细胞死亡相关的程序，如坏死、凋亡或自噬相关的细胞死亡[14-16]。其中，线粒体凋亡途径被认为是脑缺血后脑损伤的关键事件[14]，其具体路径为再灌注期间线粒体受损，线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，Δψm)下降，大量活性氧堆积，B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族促凋亡因子激活，Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、Bak的高表达使线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放，将细胞色素C释放到胞质中，在脱氧ATP和ATP共同存在的条件下与凋亡蛋白酶活化因子1相互作用，聚合形成凋亡小体，通过胱天蛋白酶(caspase)募集结构域募集到caspase-9前体，从而促进其裂解成活性形式，随后通过级联反应激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等下游因子，使线粒体不可避免地发生凋亡，最终导致细胞死亡[17]。可见，内在凋亡途径起源于线粒体损伤，且线粒体在整个凋亡过程中发挥核心调节作用，即在某种意义上线粒体决定着神经元细胞的存活和死亡[18]。再灌注后ATP衰竭、活性氧大量堆积、氧自由基损伤、Ca2+超载、mPTP异常开放、Δψm异常、血脑屏障破坏、线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)受损、线粒体自噬等病理过程均可导致线粒体障碍，从而诱导线粒体凋亡通路，导致脑细胞损伤甚至死亡。
3.1ATP衰竭 能量代谢障碍被认为是CIRI发生的始发环节。脑缺血后，脑内氧分压持续下降，大部分有氧氧化途径转变为无氧糖酵解途径，ATP合成减少，Na+,K+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性降低，大量乳酸在脑中蓄积，细胞内H+浓度升高，受损组织发生代谢性酸中毒[19]。而过多H+又促使大量自由基产生[20]、细胞内Ca2+浓度升高[21]等，进一步造成组织损伤。
再灌注过程中，脑组织血氧供应恢复，同时大量线粒体损伤，线粒体呼吸链破坏，但此时线粒体有氧再灌注的恢复仍不能使脑组织进行有效的有氧氧化产能，导致在再灌注恢复后相当长的一段时间内，糖酵解仍是脑组织的主要产能途径[22]，该阶段酸中毒进一步加重，储存的能量迅速被消耗，细胞和线粒体进一步损伤，最终导致细胞凋亡。
3.3Ca2+超载 在生理条件下，细胞内Ca2+浓度约为细胞外Ca2+浓度的10 000倍，在体内神经调节及传递中起重要作用。再灌注期间，各种不利因素会导致细胞内Ca2+超载。而Ca2+的超负荷可通过以下多种途径加剧线粒体损伤，并最终导致细胞死亡。①Ca2+超载诱导多种线粒体蛋白的去磷酸化，抑制ATP合成，并加速能量耗竭；
②超量的Ca2+也会导致膜电位下降，并使mPTP开放的阈值下降，决定了mPTP的开放程度[28]；
③Ca2+超载会释放大量非酯化脂肪酸，如花生四烯酸，导致线粒体膜的流动性减慢及通透性升高，使线粒体肿胀[29]，脑水肿加重。
3.4mPTP异常开放 mPTP是位于线粒体内、外膜之间的非特异性高导电性通道，主要由线粒体内膜上的腺嘌呤核苷酸转移酶、线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道、基质上的亲环蛋白D及其他蛋白组成的多蛋白复合物[30-32]，其受到基质中Bcl-2蛋白家族中的20多种蛋白、磷酸盐载体、己糖激酶、肌酸激酶、外周苯并二嗪受体等的调节，维持膜内外离子的相对平衡，控制线粒体膜的通透性，参与保持稳定的电势差和膜电位的过程。生理情况下，mPTP处于关闭状态，通过控制线粒体氧化磷酸化来调节能量代谢。
再灌注期间，pH值增加，Ca2+、活性氧浓度逐渐持续升高，导致mPTP持续开放，分子量低于1 500的分子非选择性进入线粒体内膜[28]，从而破坏了Δψm，与氧化磷酸化解偶联并导致ATP缺乏和细胞死亡。再灌注也增强了Bcl-2家族相关凋亡因子的激活，通过与电压依赖性阴离子通道及其他促凋亡蛋白相互作用，形成蛋白渗透性孔，诱导mPTP开放，促进凋亡相关蛋白释放。mPTP的另一个重要作用是使线粒体膜通透性增加，线粒体肿胀而使线粒体受损[22,33]。有研究表明，阻断再灌注后mPTP病理性开放是减少神经元细胞凋亡、减轻CIRI的靶点之一[34]。
3.5Δψm异常 由三羧酸循环产生的还原当量还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型黄素腺嘌呤二核苷酸分别将电子提供给复合物Ⅰ和复合物Ⅱ，这些电子通过呼吸链及复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ将质子从线粒体基质跨过内膜泵入膜间隙所形成的电位差，即为Δψm。Δψm通过复合物Ⅴ提供质子流入的驱动力，将腺苷二磷酸和无机磷酸盐浓缩生成ATP[35]。Δψm既是氧化磷酸化过程中能量储存的中间形式，为ATP合成提供驱动力，也是决定线粒体活性的一个因素，反映线粒体功能的完整性[36]。
研究发现，在缺血环境应激下，线粒体Ca2+聚积，导致细胞色素C和其他线粒体呼吸链蛋白的去磷酸化[37]。再灌注过程中，线粒体呼吸链过度激活，出现病理性高Δψm，活性氧呈指数级增加，反过来诱导Δψm快速去极化，进一步加重呼吸链损伤，最终导致ATP产能障碍，触发细胞凋亡。目前，应用“温和解偶联剂”改善氧化应激水平，维持Δψm的最佳值，纠正线粒体损伤，可能成为脑组织保护的新方向。
3.6血脑屏障破坏 血脑屏障主要由脑毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞终足、基底膜及周细胞组成，是控制血液和脑组织间物质交换的复杂细胞系统[38]。正常生理状态下，绝大多数化合物无法通过血脑屏障进入脑组织，仅有一些脂溶性小分子和气体分子可以进入，可有效防止有害物质侵入脑组织[39]。血脑屏障的完整性可维持中枢神经系统的功能，防止神经元损伤并改善神经功能[40]。
再灌注时，大量自由基促使细胞膜和毛细血管脂质过氧化，引起血管内皮细胞和基底膜损伤，血脑屏障结构异常、完整性遭到破坏时，血脑屏障通透性增加，大分子物质进入脑组织和血浆成分外渗，导致脑水肿，是导致脑梗死致残性并发症的重要原因，直接影响患者预后[41]。
3.7mtDNA受损 线粒体是真核生物细胞中仅16 kb的半自主性细胞器，mtDNA具有独立于细胞核染色体外的遗传体系，含37个基因，其出现任何缺失和(或)突变均有可能影响线粒体功能，并导致细胞死亡[42]。mtDNA与氧化磷酸化场所(即线粒体内膜之间的空间)的距离较近，且mtDNA自身结构没有组蛋白保护、缺乏有效的DNA修复系统，故易受到线粒体呼吸链产生的自由基攻击，导致mtDNA突变[43]。
再灌注时，活性氧暴增，mtDNA与活性氧产生部位邻近，且mtDNA本身缺乏对损伤的自我修复能力，不能通过对损伤DNA碱基的切除进行修复，易受到活性氧攻击导致mtDNA缺失和(或)突变，导致线粒体结构破坏和功能受损，最终导致细胞死亡。同时，mtDNA数量减少、线粒体生成能力下降，可引起线粒体氧化磷酸化功能下降，导致神经元细胞因能量匮乏而死亡。
3.8线粒体自噬 线粒体自噬是一种选择性自噬过程，受到各种因子的精密调节，可识别机体内受损的线粒体并及时清除，是调整线粒体数量的一种重要机制，主要通过PTEN诱导假定激酶1/Parkin介导[44-45]。有研究表明，线粒体自噬对机体的作用是双向的，在一定程度上，线粒体自噬呈良性表达，通过清除体内异常线粒体，减轻CIRI；
但自噬可随着再灌注导致的病理变化而过度激活，从而加重CIRI[46]。再灌注后，线粒体外膜蛋白Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3表达增加，自噬过度激活，线粒体裂解加速，引发细胞凋亡，加重CIRI[47-48]。
4.1中医治疗 目前，有关脑缺血研究已取得较多进展，中医药治疗因具有副作用小、高效等优点而受到研究者的关注。有研究证明，桑枝[49]、丹参[50]、灯盏花、细辛[51]、黄芪[52]、天麻等药物可减轻氧化损伤，进而减轻CIRI；
三七总皂苷[53]能降低大鼠脑内Ca2+浓度，并使线粒体跨膜电位升高，阻断mPTP开放，从而减轻CIRI；
牛黄[54]可通过抑制线粒体介导的凋亡信号通路，降低大鼠大脑中Bax、caspase-9、caspase-3和细胞色素C蛋白的表达，对CIRI发挥保护作用。败酱总黄酮[55]可以改善脑组织能量代谢，减轻自由基损伤，保护脑组织。除传统中药外，电针疗法也被广泛用于CIRI的治疗。
电针在CIRI中的应用主要包括电针预处理和电针治疗两方面，电针预处理可通过减轻兴奋性氨基酸毒性、调控细胞凋亡相关基因等减轻CIRI；
电针治疗主要通过调节能量代谢、促进血管生成等减轻CIRI[56]。有研究表明，电针预处理可提高Bcl-2表达、降低Bax和caspase-3的表达，使细胞凋亡水平下降，从而抑制大鼠脑组织细胞的凋亡，发挥脑保护作用[57]。此外，电针可通过清除自由基、抑制大鼠脑内的氧化应激，减少过氧化物的产生，保护神经细胞[58]。研究表明，3 mA强度电针可通过调节大鼠脑线粒体的能量代谢减轻大鼠CIRI[59]。电针“百会”“大椎”穴可维持再灌注后线粒体的稳定性，减少凋亡的发生[60]。
4.2西医治疗 细胞、动物和人体研究的新发现表明，胎盘来源的线粒体移植可以减少脑缺血再灌注后的梗死[61]。木犀草素可通过逆转线粒体肿胀和线粒体跨膜电位增强抗氧化能力[4]。此外，木犀草素可通过激活沉默信息调节因子3/AMP活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径增强线粒体功能，减缓CIRI的病理进展。瑞舒伐他汀通过调控解偶联蛋白2-沉默信息调节因子3通路减轻再灌注对神经元线粒体的损伤，从而发挥保护作用[62]。马赛替尼能下调大鼠微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Bax等凋亡蛋白的表达，上调p62的表达，通过抑制线粒体过度自噬减缓CIRI病理进程[63]。
CIRI与线粒体功能障碍密不可分，恢复线粒体的结构和功能有助于CIRI的预防和治疗。天麻、丹参等中药可作用于多靶点，减轻线粒体损伤，对CIRI有保护作用；
此外，中医电针、胎盘来源线粒体移植等技术也在CIRI中相继应用，且疗效明显。可见，从线粒体入手治疗对CIRI有重要意义，但目前大多限于基础研究(细胞水平、动物实验)，临床诊断治疗应用率低，且线粒体功能障碍涉及复杂的病理过程，诸多文献仅为单一机制的研究，未来应系统研究线粒体在脑缺血再灌注病理过程中的作用，从而为靶向治疗脑梗死提供新思路。
