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孙超男，梁家齐，于昊彤，热依莱，杨 珂，魏千皓，赵 刚
(吉林大学公共卫生学院 国家卫生健康委员会放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021)
免疫检查点抑制剂(ICB)如：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配体(PD-L1)抗体在临床取得成功，引起肿瘤免疫治疗研究的热潮。然而，只有不到50%的癌症患者适用于这种免疫疗法，在适用于这种疗法的患者中，也只有不到50%的患者真正从中受益[1]。肿瘤突变负荷低，肿瘤局部T细胞浸润程度低，是导致ICB无法发挥作用的最常见因素[2-3]。因此，肿瘤免疫治疗取得成功的关键是增加T淋巴细胞在肿瘤局部的浸润。为了增强抗肿瘤免疫反应的疗效，目前常规的做法是高剂量肿瘤局部单次外照射与免疫治疗联合应用。这样做的理论依据是大剂量局部单次外照射起到肿瘤局部“原位疫苗接种”的效果，这种“原位疫苗接种”效应会进一步诱发“远端效应”，“远端效应”主要指局部放疗触发全身抗肿瘤作用，诱导远处非靶向肿瘤消退[4]。但是，在实际临床应用中，高剂量肿瘤局部单次外照射与免疫治疗联合应用诱发的这种远端效应较为罕见[5]。这种单次肿瘤局部高剂量照射能够改变非靶其他部位肿瘤微环境的想法未免不切实际，因为肿瘤微环境是由肿瘤细胞和其周围的宿主细胞相互作用共同决定的，是受到宿主周围癌旁组织和正常组织的遗传背景和分子状态影响的[6-7]。虽然单次照射的“肿瘤疫苗原位接种”的概念可能没有错，但是临床上众多的肿瘤疫苗的失败表明，要想消灭肿瘤，除了诱发机体的系统抗肿瘤免疫反应外，还必须改变肿瘤微环境(TME)[8]。而且单次大剂量照射的毒副作用和诱发的免疫抑制作用，都限制了其应用。研究表明，小剂量照射(这里指<3 Gy的剂量)可以激发机体的固有免疫和适应性免疫，从而有利于后续的免疫治疗的进行[9-11]，本文对其进行简要综述。
Patel等[9]研究发现，应用放射性核素90Y-NM600与ICB联合应用，在治疗B78黑色素瘤小鼠模型中发挥了良好的抗瘤效果，即低剂量靶“向放射性核素治疗联合ICB可提高临床前肿瘤模型的完全缓解率”。该研究中的NM600是一种治疗性烷基磷酸胆碱类似物，优先积累在几乎所有的肿瘤类型中。NM600螯合放射性同位素钇90，即90Y-NM600半选择性地将其传递到TME，用于肿瘤的治疗或诊断。钇90发射的是β射线，在体内的照射半径是3.9 mm。钇90所发出的β射线几乎全部被周围的肿瘤组织所吸收，对临近的骨髓、脾脏和周围淋巴结的影响很小。临床前动物实验表明，90Y-NM600在生物学分布、肿瘤选择性等方面都是安全的，适合人类应用，相关的更严格的临床测试还在进行当中[10]。作者所测试的剂量范围为0～5 Gy内，研究发现，低剂量(<2.5 Gy)靶向放射性核素对肿瘤局部的照射，可明显增加肿瘤局部髓性淋巴细胞CD11b+和NK细胞的浸润，并上调了CD8+/CD4+CD25+FOXP3+的比值，从而增强了肿瘤细胞对随后ICB治疗的反应。
该研究显示2.5 Gy的90Y-NM600发挥了良好的抗B78黑色素瘤的效果，这种局部低剂量内照射使TME发生了免疫重编程，上调Ⅰ型干扰素(IFN)的表达，这种作用依赖于照射后激活的STING[cGMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS)/stimulator of interferon genes]通路，表现在敲除了STING通路的小鼠(Tmem173-/-)，治疗作用也随之消失。通过高纬度表型流式细胞术和转录组学分析也证明，低剂量内照射使TME中的免疫细胞和内皮细胞发生重编程。与钇90半衰期是2.5 d这个规律相吻合，这种变化的效果是短暂的，于引入钇90内照射14 d后重返照射前的基准水平。在随后的实验中，90Y-NM600与ICB制剂CTLA-4单克隆抗体联合应用，与90Y-NM600或CTLA-4单独应用相比，流式细胞术和T细胞表面受体(TCR)测序都证明联合应用显著提高了CD8+T细胞的总量、TME中的记忆性T细胞和先天γδT细胞，同时，CD8+T表现出更强的克隆扩增性和更少的功能衰竭性。与单独治疗相比，联合治疗也显著提高了荷瘤鼠的生存率和生存时间。进一步的研究证实，在90Y-NM600与ICB联合应用的基础上，再加入单次大剂量肿瘤局部外照射(12 Gy)，其抗瘤效果更佳，并容易诱发“远端效应”，其抗瘤效果优于任何一项或两项单独使用。此外，在联合治疗后获得长期肿瘤清除的小鼠产生了保护性免疫记忆。因此推测，90Y-NM600的低剂量内照射和单次大剂量外照射之间起到一个互补作用，从而进一步增强了肿瘤对ICB的反应，收到了良好的抗瘤效果。
总之，该研究显示，低剂量靶向核素内照射可使TME发生免疫重编程，并将“冷肿瘤”转化为免疫反应性和ICB反应性肿瘤。这些发现为低剂量靶向核素内照射联合ICB治疗“冷肿瘤”的临床应用提供了理论基础。
有研究者把低剂量外照射与ICB联合应用于ID8上皮卵巢癌小鼠模型的治疗中[11]。通常，人类上皮卵巢癌对ICB治疗是抗拒的，因为卵巢癌组织内T细胞浸润太少[12]。研究者用0.5～2 Gy剂量外照射小鼠整个腹部，结果显示1 Gy照射的效果最佳，体现在“冷肿瘤”浸润了更多的淋巴细胞、单核细胞、树突细胞和NK细胞，并且CD8+/Treg 细胞比值也最高。这种低剂量腹部外照射，目的是使TME发生了免疫重编程，促进免疫细胞浸润，而不是直接杀灭肿瘤细胞。这种低剂量照射的效果是短暂的，1 w后消失，T细胞浸润恢复到照射前水平。然而，如果重复1 Gy/(次·w)，这种T细胞浸润的效果就能够持续。更重要的是，研究者发现，在1 Gy照射后第5天，免疫治疗的靶基因开始上调，这些基因包括共抑制性T细胞受体PD-1和CTLA-4，Treg细胞表面的FOXP3，抗原递呈细胞表面的CD40受体。这些发现提示，可以设计一种更全面的联合治疗方案，包括ICB使T细胞抗瘤作用更强，CD40配体刺激抗原递呈细胞和低剂量环磷酰胺减弱Treg细胞。研究者展开了一个为期3 w的这种联合治疗方案，这种方案包括：1 Gy外照射，包括整个腹部；
抗PD-1和CTLA-4的抗体；
CD40受体激动剂和低剂量的环磷酰胺，作者称之为RACIM(radio-combinatorial immunotherapy)。这种联合治疗的肿瘤反应率为83.5%，治愈率为15.0%，而其他方案对这种卵巢癌的治疗是无效的。反褶积实验(不含其中一种成分的RACIM)证实，“鸡尾酒”中的所有成分都是生存获益所必需的，去掉其中任何一种，都达不到理想的抗瘤效果。
RACIM治疗可增加肿瘤局部浸润淋巴细胞中的TCF1- PD-1+、CD4+和CD8+的效应T细胞数量，并高表达γ-IFN，颗粒酶B和穿孔素。RACIM也诱导出两个新的树突细胞亚群cDC2(conventional DCs type2)和MoDCs(monocyte-like DCs)，这两个亚群都高表达NKG2D(NK group 2D)配体RAE1[13]。此外，在RACIM治疗的肿瘤中，具有衰竭表型的CD4+和CD8+肿瘤局部浸润T细胞上调了NKG2D共刺激因子受体。这些表现都是相互关联的，因为这些表达NKG2D共刺激因子受体的肿瘤局部浸润T细胞定义了一个具有高效应和增殖能力的典型的衰竭表型T细胞子集。实验证实，如果用抗体封闭了NKG2D，RACIM的治疗作用也就消失了。进一步实验证实，如果用Fingolimod(FTY720)抑制了T淋巴细胞从周围淋巴结的迁移，RACIM的作用也消失，表现在小鼠生存率下降，这个实验证明，RACIM发挥作用依赖于T淋巴细胞从周围淋巴结向肿瘤周围的迁移和聚集。
研究者在动物实验的基础上进一步开展了临床一期观察(NCT0378179)[11]：研究者制定了严格的纳入标准，共观察了8例患者，包括转移性卵巢癌、前列腺癌、胆囊癌和结肠癌，他们的肿瘤经诊断都属于免疫沙漠型肿瘤。具体的联合给药方案为：低剂量外照射整个腹部(0.5或1 Gy/次，共2 w，连续照射，中间停1 d，总剂量为6或13 Gy)，低剂量环磷酰胺，ipilimumab，nivolumab和阿司匹林，其中ipilimumab和nivolumab为ICB上市药物，分别是针对PD-1和CTLA-4的中和抗体。研究者称此方案的为RACIN(Radiation,Aspirin,Cyclophosphamide,Ipilimumab,Nivolumab)。经过1个疗程治疗后，这8例患者中的3例，经CT或PETS-CT诊断，照射野范围内肿瘤完全消除，4例照射野范围内肿瘤缩小，只有1例无反应，继续长大。大于3级的免疫相关不良事件的发生率为25%，包括大肠炎、肝炎和心肌炎。与前期动物实验相似，GeoMx空间转录谱分析证实，RACIN治疗导致TME周围CD4+、Th1、CD8+和效应性记忆T淋巴细胞聚集增多。与此相反，那1例治疗效果不好的病例中，TME周围的这些细胞聚集没有变化，而抗炎型M2巨噬细胞却增多。在治疗效果良好的那7例患者中，低剂量照射野范围内的肿瘤都消退或者消失了，而照射野外的转移瘤却并未有反应。这个结果表明，低剂量照射增强ICB的效果不是依赖于“远端效应”，而是低剂量照射对TME直接改变的结果。进一步推测，局部外照射改变了TME中的免疫环境，发生了免疫重编程，从而有利于后续的ICB治疗清除肿瘤，尽管具体的细节还不清楚。这项研究最值得关注的点就是，TME的免疫重编程只局限于低剂量照射野范围内，而照射野范围外并无此效应。
动物实验和人体实验的结果都表明，低剂量外照射可以安全应用于实体瘤，多发性转移瘤治疗，使TME中的免疫细胞发生免疫重编程，使处于免疫沙漠型的“冷肿瘤”转化为免疫反应型的“热肿瘤”，从而有利于后续ICB的治疗。
研究表明[14]，用大剂量照射一处较大肿瘤(12 Gy/次，共3次)，结合低剂量照射多处较小的继发性转移瘤(1 Gy/次，共2次)和ICB治疗129Sv/Ev小鼠的344SQ-P肺癌。结果显示，低剂量照射使TME周围的巨噬细胞向M1型转化，并降低起免疫抑制作用的转化生长因子(TGF)β含量，与单次大剂量照射和ICB结合，收到了良好的抗瘤效果。抗肿瘤作用依赖于固有免疫和获得性免疫的综合作用，特别是NK细胞、CD4+和CD8+的T淋巴细胞。研究者在动物实验的基础上，进行了临床一期的观察(NCT02710253)，入选共8例患者，是对常规的ICB治疗抗拒，包括头颈部鳞状细胞癌、鼻咽癌、间变性甲状腺癌、默克尔细胞癌、唾液腺癌、神经母细胞瘤和黑色素瘤，联合治疗方案包括大剂量照射、低剂量照射和ICB治疗。临床结果显示，这种联合治疗方案安全有效。入选的8例患者中有5例效果明显。特别值得注意的是其中1例多转移性口咽鳞状细胞癌，经联合治疗6个月后，肿瘤几乎完全消失。另1例黑色瘤患者的肿瘤也是几乎完全消失。这些令人鼓舞的临床前和临床数据表明，低剂量大面积照射转移瘤，可增强后续局部大剂量照射对肿瘤的直接杀伤作用和“远端效应”，增强ICB的治疗作用，低剂量照射在肿瘤治疗中可能发挥重要辅助作用，使那些对传统ICB治疗抗拒的肿瘤患者获得新生。
以上临床前和临床试验数据充分说明，低剂量照射在治疗转移瘤中的重要作用[9,11,14]。这种重要作用体现在低剂量照射促进T细胞向肿瘤局部浸润，使免疫抑制型M2型巨噬细胞向抗肿瘤型M1转化，使肿瘤局部脉管系统恢复正常，促进T细胞归巢和活化，增殖，最终分化为效应性T细胞发挥抗肿瘤作用[15]。
低剂量照射全部可见的转移瘤病灶，可使“冷肿瘤”的固有免疫和适应性免疫反应都调动起来，并阻止了免疫抑制途径，低剂量照射适合与ICB联合应用。证明传统的单次大剂量照射完全可以和低剂量照射相结合，发挥各自的互补作用，使单次大剂量照射的“远端效应”发生的概率增加[9，11，14]。
低剂量靶向放射性核素治疗与低剂量外照射相比，有显著的优势，即低剂量靶向放射性核素可以沉积在一些影像学尚无法辨别的微小肿瘤组织内发挥作用。因此未来的研究方向是开发更多种类、品质更好的低剂量放射性核素，例如那些已经在医学领域应用的，如发射α射线的镭223和发射β射线的镥177，是否可以靶向肿瘤局部和ICB联合发挥抗肿瘤作用。另外，高剂量照射诱发的肿瘤本身的免疫抑制作用是否同样会发生在低剂量照射与ICB联合治疗中，这些问题都是有待探讨的关键点。未来的工作中，还需要明确针对不同肿瘤，小剂量的范围以及照射的时间和顺序，小剂量照射的最大耐受剂量或者最多耐受次数也需要探索，究竟哪种ICB药物最适合与小剂量照射联合应用，药物的用量和用药顺序等等一系列的问题，均有待于深入研究和探索。
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