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公智卿，陈怿鹏，卢冬梅，辛丽丽，郭 菁，邢广群
(青岛大学附属医院 肾病科，山东 青岛 266555)
腹膜透析相关性腹膜炎(peritoneal dialysis-associated peritonitis，PDAP)是腹膜透析常见的并发症，可以影响腹膜的结构和功能，并引起腹膜透析技术失败以及严重的包裹硬化性腹膜炎，危及患者生命。对病原体的及时精准诊断、尽早选用敏感的抗生素是最有效的措施[1-2]。腹膜炎的主要致病菌有细菌和真菌，覆盖细菌表面的复杂多聚糖网络在革兰阴性菌和革兰阳性菌之间是不同的，革兰阴性菌被两层细胞膜包裹，两层细胞膜被一层肽聚糖层隔开，并在外膜中含有脂多糖。相比之下，革兰阳性细菌细胞膜只有厚厚的肽聚糖层覆盖[3]。细菌多糖通常是由双糖至八糖形成的规则的重复单位构成，这些聚糖的精确结构可能在具有相同细胞表面结构的细菌之间存在显着差异，甚至在同一细菌物种的不同菌株之间也可能存在差异[4]。构成细菌常见的单糖有甘露糖、葡萄糖、岩藻糖等。革兰阴性菌中含有的脂多糖是由脂质A，核心多糖和O抗原组成的脂质和多糖的复合物，Milan Manani等[5]研究表明，革兰阴性菌腹膜炎患者的透析液中脂多糖水平较革兰阳性菌腹膜炎腹透液和正常腹透液显著升高。真菌细胞壁中含有半乳甘露聚糖和(1→3)-β-D-葡聚糖，其在真菌生长和组织侵袭过程中会释放到周围环境中，Worasilchai等[6]研究表明，检测腹膜透析液中半乳甘露聚糖和(1→3)-β-D-葡聚糖的含量可以作为真菌性腹膜炎的早期诊断。
目前对腹膜炎患者腹膜透析液中单糖研究较少，高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)具有应用范围广、分析速度快、敏感度高和耐盐污染等优点，广泛应用于降解后单糖含量测定、食品中成分测定、药物含量测定等领域[7]。Trezzi 等[8]应用色谱法研究表明，测定脑脊液中单糖成分变化可以用于早期诊断帕金森病。因此，本研究将应用高效液相色谱法对腹膜透析液中由多聚糖降解后的单糖水平进行分析，探究腹膜透析相关性腹膜炎患者腹透液中单糖水平的差异。
1.1病例选择 2020年10月01日到2021年10月31日到青岛大学附属医院西海岸肾病科住院的透析龄>3个月、年龄≥18岁的腹膜透析患者90例，收集患者腹膜透析液样本，包括无腹膜炎腹膜透析液样本52个，腹膜炎腹膜透析液样本38个，其中革兰阳性菌腹膜炎腹膜透析液样本24个，革兰阴性菌腹膜炎腹膜透析液样本14个。PDAP的诊断标准：参照2022年国际腹膜透析协会 (ISPD)指南, 符合以下3项中2项及以上者可诊断为PDAP：(1)腹痛和(或)透出液浑浊，伴或不伴发热；
(2)透出液白细胞计数超过100×106/L，其中多形核中性粒细胞达50%以上；
(3)透出液微生物培养阳性[1]。本研究获得青岛大学附属医院伦理委员会批准(审批文号：QYFYWZLL26672)。
1.2实验与方法
1.2.1实验仪器 PCR仪(T100 Thermal cycler)购于新加坡Thermal Cycler公司；
涡旋振荡器(VG 3 S25, VORTEX GENIUS3)购于德国IKA 仪器设备有限公司；
掌上离心机(LX-100)购于江苏其林贝尔仪器有限公司；
高速离心机购于美国Thermo公司；
磁力搅拌器(C-MAG HS7)购于德国IKA 仪器设备有限公司；
高效液相色谱仪(HPLC，Agilent 1260/1290)、Eclipse XD B-C18 色谱柱(150 mm*4.6 mm，5 μm)购于美国Agilent公司；
超声波振动清洗器(KH7200E)购于昆山禾创超声仪器有限公司；
电子天平(TP-213 型)购于北京丹佛仪器有限公司；
PH 计(雷磁 PHs-3C)购于上海精密科学仪器有限公司；
Simplicity UV 纯水仪购于德国Millipore公司；
烘箱购于上海三发科学仪器有限公司。
1.2.2实验试剂 三氯甲烷购于天津科密欧化学试剂有限公司；
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)购于美国Sigma Aldrich 公司；
单糖标准品购于美国Sigma公司，色谱甲醇、乙腈、甲醇均购于Merck公司浓盐酸溶液、NaOH溶液、乙酸铵、冰醋酸均购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2.3方法 留取无腹膜炎患者入院当天腹透液和腹膜炎患者初入院经验性抗生素使用之前的第一袋1.5%葡萄糖浓度的腹膜透析液，无菌操作采集患者留腹>2 h的腹膜透析液20 ml，放入-80 ℃冰箱中保存，同时抽取20 ml注入需氧、厌氧血培养瓶中。将所有收集的腹膜透析液样本一式三份，测定3次单糖浓度取平均值。取5 μl腹膜透析液加入八连管的底部。八连管加盖后放入PCR仪中，温度设置为100 ℃, 降解10 min。经过一系列实验处理后，最终取50 μl上清液于棕色上样瓶内，随后用HPLC进行色谱分析[检测波长245 nm；
色谱柱温37 ℃；
进样量20 μl；
流速1 ml/min；
流动相配置：85%乙酸铵-乙酸缓冲溶液(PH=5.5)、15%乙腈][9]。
2.13组临床资料比较 腹膜炎组与无腹膜炎组在体质量指数(BMI)、白蛋白、C反应蛋白(CRP)、血钠、血钙、血磷上差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。腹膜炎组与无腹膜炎组甘露糖、葡萄糖和岩藻糖的浓度差异均有统计学意义(P<0.01)。革兰阳性菌腹膜炎组与革兰阴性菌腹膜炎组甘露糖浓度差异有统计学意义(P<0.01), 见表1～2。
腹膜透析相关性腹膜炎病原菌构成见表3。
表1 3组临床资料比较
表2 腹膜透析液降解单糖浓度比较(μmol/L)
表3 腹膜透析相关性腹膜炎病原菌构成情况
2.2Logistic回归分析 对无腹膜炎组和腹膜炎组进行logistic回归分析示，岩藻糖浓度是腹膜炎发生的独立危险因素(P<0.01), 见表4。对革兰阳性菌腹膜炎组和革兰阴性菌腹膜炎组进行亚组分析，根据ROC曲线结果，对甘露糖浓度进行赋值后行logistic回归分析，结果表明甘露糖浓度是革兰阳性菌腹膜炎发生的独立危险因素(P<0.01), 见表5～6。
表4 腹膜炎影响因素的logistic回归分析
表5 变量赋值说明
表6 革兰阳性菌腹膜炎影响因素的logistic回归分析
2.3ROC曲线分析 降解的岩藻糖诊断腹膜炎的AUC是0.820，95%CI(0.732，0.908)，敏感度为71.05%，特异度为84.62%，最佳截断值为3.045 μmol/L。降解甘露糖对革兰阳性菌腹膜炎诊断的AUC是0.863, 95%CI(0.740，0.986)，敏感度为78.57%，特异度为83.33%，最佳截断值为0.345 μmol/L, 见图1～2。
图1 降解的岩藻糖诊断腹膜炎的ROC曲线 图2 降解的甘露糖诊断革兰阳性菌腹膜炎的ROC曲线
在全球范围内，腹膜透析相关性腹膜炎的发生率估计为0.24～1.66次/患者年[1]。传统的病原菌实验室培养时间长，耗时约为3～5 d，培养阳性率与腹水中病原菌数量和种类密切相关，有些患者虽然有非常明确的细菌感染炎症表现，腹膜透析液培养的病原学却是阴性，影响了抗生素的选择和治疗。基于此，国内外一直在不断探索改进检测手段。目前有质谱检测、16s rRNA基因测序、纳米材料检测等均可以减少培养时间，有一定的敏感度和特异度，但成本高昂、不能提供药敏信息、需要特殊检测仪器等问题，限制了它们的应用[10-13]。
本研究利用HPLC，通过酸降解和PCR后进行色谱分析，检测腹膜透析液中降解的单糖水平，发现腹膜透析相关性腹膜炎患者的透析液相较于无腹膜炎患者的透析液，降解的葡萄糖、岩藻糖含量是显著降低的，甘露糖浓度在革兰阳性菌腹膜炎感染中也是降低的。腹膜透析液中葡萄糖浓度的变化对腹膜透析相关性腹膜炎的患者而言没有意义，主要有以下原因：不同的患者腹膜功能不同，腹膜透析液的留腹时间、腹膜透析液的葡萄糖浓度不同和腹腔内病原体生长消耗都会影响葡萄糖的浓度。岩藻糖和甘露糖浓度的降低考虑与腹腔内病原体生长消耗、体内炎症状态等有关。与革兰阳性菌腹膜炎组相比，革兰阴性菌腹膜炎组腹膜透析液中甘露糖的水平高，首要考虑是因为覆盖细菌表面的复杂聚糖网络在革兰阴性菌和革兰阳性菌之间有所不同。其次，既往研究显示，腹膜透析液中甘露糖浓度升高，对革兰阴性菌感染引起的炎症反应具有抑制作用，与机体自身的免疫反应有关[14-15]。在临床上，我们对遇到的3例培养阴性的腹膜炎患者进行腹膜透析液的甘露糖浓度检测，结果提示有2例患者的腹膜透析液甘露糖浓度小于0.345 μmol/L，提示存在革兰阳性菌感染，给予对革兰阳性菌敏感的头孢唑林后治愈；
1例患者的甘露糖浓度大于0.345 μmol/L，提示存在革兰阴性菌感染，给予对革兰阴性菌敏感的头孢他啶后治愈，这进一步验证了我们的研究成果。
综上，本研究发现，腹膜透析相关性腹膜炎发生时，降解的岩藻糖水平明显下降，对腹膜炎有明确的提示作用；
检测腹膜透析液的甘露糖浓度可以早期鉴别革兰阳性菌腹膜炎及革兰阴性菌腹膜炎。HPLC相较于基因测序，检测时间短、检测成本低，对临床上早期判断病原菌种类，选用适当抗生素有一定的指导意义。本研究为单中心研究，病例数较少，没有纳入真菌性腹膜炎患者，检测单糖种类较少，还需要进一步对结果进行验证。
