【www.zhangdahai.com--其他范文】
曹小妹，乐伊婕，林佳芝，宁舒婷，邱叶贝，曹建国，杨剑锋，宁映霞
（1.湖南师范大学医学院，长沙 410013；
2.广州医科大学附属第一医院，广州 510120）
癌细胞的能量代谢重编程主要表现为有氧糖酵解，亦称为沃伯格效应，是恶性肿瘤的一个标志［1］。在包括卵巢癌在内的多种类型肿瘤中，miR-199a-5p 呈低表达状态并且发挥抑癌作用［2］。我们先前证实，金雀异黄素，一种大豆及其制品的主要活性成分具有抗卵巢癌活性［3］。尽管已有研究报告金雀异黄素通过抑制肝细胞癌HIF-1α/GLUT1/HK2 信号轴介导的糖酵解诱导肝细胞癌细胞死亡［4］，然而，金雀异黄素能否调控卵巢癌细胞miR-199a-5p 表达和糖酵解仍然有待深入研究。
1.1 细胞培养与处理 人卵巢癌细胞系SKOV3 细胞购自中国科学院细胞库（中国上海市）。按照先前文献的描述［3］，细胞用含10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素G和链霉素溶液的DMEM 细胞培养基，置37°C、饱和湿度的5% CO2 培养箱中单层贴壁生长；
此外，我们用预备实验确定的亚细胞毒浓度的金雀异黄素（genistein，GEN：20、40µM）处理SKOV3 细胞24 小时。
1.2 miRNA 转染 如先前文献［5］的方法，按照制造商的说明（RiboBio，中国广州市），用iboFECT™CP 试剂转染micrON™miR-199a 模拟物或抑制物（50 nM）（RiboBio，中国广州，cat. no.miR112111170919-1-5）入SKOV3 细胞。此外，按照上述转染的方法和步骤完成miR-199a 模拟物（miR-NC）的阴性对照或miR-199a 抑制物（Anti-Cont）的阴性对照的转染。
1.3 qRT-PCR 参考文献［2］的实验方法，用miRcute miRNA 分离试剂盒（cat. DP501，Tiangen Biotech，中国）制备总microRNA。基于TaqMan MicroRNA 分析（Applied Biosystems）的All-in-One™miRNA qRTPCR 检测试剂盒转录和扩增总miRNA（2μg），以测定microRNA 的量。U6 RNA 用作内参。用2-ΔΔCt方法分析结果。miR-199a-5p 和内参 U6 引物如下：
1.4 乳酸产物和葡萄糖消耗的测定实验 根据文献［6］的方法，使用不含酚红的DMEM 培养基培养肿瘤细胞24 小时后收集细胞培养液。然后，用葡萄糖检测试剂盒测定细胞培养液中的葡萄糖浓度根据与对照组相比的葡萄糖浓度差异确定葡萄糖消耗量。乳酸检测试剂盒检测细胞培养液中的乳酸水平。
1.5 统计学分析 各组实验数据录入SPSS 20.0 for windows evaluation 软件建立数据库，所有数据用均数±标准差 表示，采用One Way ANOVA 方差分析；
多组均数比较采用Dunnett"s t test 检验。P<0.05 为有统计学意义。
2.1 miR-199a-5p 抑制卵巢癌SKOV3 细胞的糖酵解 乳酸产物和葡萄糖消耗测定实验结果显示，miR-199a-5p 转染显著降低卵巢癌SKOV3 细胞的乳酸产生（图1 A；
P<0.05）和葡萄糖消耗量（图1B；
P<0.05）。
图1 miR-199a-5p对SKOV3细胞糖酵解的影响与培养基处理SKOV3细胞（Ctrl）相比：* P<0.05；
与miR-199a-5p 模拟物阴性对照（miR-NC）转染的SKOV3细胞相比：# P<0.05（mean±SD，n=3）。
2.2 金雀异黄素上调卵巢癌SKOV3 细胞miR-199a-5p 表达 实时荧光定量PCR 实验结果表明，与0.1 %DMSO 处理SKOV3 细胞相比，亚细胞毒浓度的金雀异黄素（20.0μM、40µM）显著上调SKOV3 细胞 miR199a-5p 表达水平；
并且金雀异黄素上调miR-199a-5p 表达的作用呈浓度依赖趋势（P<0.05），结果见图2。
图2 金雀异黄素对SKOV3细胞miR-199a-5p表达的影响与溶媒（0.1% DMSO）处理SKOV3细胞相比：* P<0.05；
与20.0μM金雀异黄（GEN）处理SKOV3细胞相比，# P<0.05（mean±SD，n=3）。
2.3 金雀异黄素抑制卵巢癌SKOV3 细胞的糖酵解乳酸产物和葡萄糖消耗测定实验结果表明，金雀异黄素减少卵巢癌SKOV3 细胞的乳酸产生（图3 A；
P<0.05）和葡萄糖消耗（图3 B；
P<0.05）。
图3 金雀异黄素对SKOV3细胞糖酵解的影响与溶媒（0.1% DMSO）处理的SKOV3细胞相比：* P<0.05（mean±SD，n=3）。GEN：金雀异黄素。
2.4 miR-199a-5p 抑制物救援金雀异黄素抑制SKOV3 细胞糖酵解作用 乳酸产物和葡萄糖消耗测定实验结果显示，miR-199a-5p 抑制物转染显著增加卵巢癌SKOV3 细胞乳酸产生（图4 A；
P<0.05）和葡萄糖消耗（图4 B；
P<0.05），并且miR-199a-5p 抑制物能消除金雀异黄素减少卵巢癌SKOV3 细胞乳酸产生和葡萄糖消耗的作用（图4 A 和4B；
P<0.05）。
图4 金雀异黄素联合miR-199a-5p抑制物对SKOV3细胞糖酵解的影响与miR-199a-5p抑制物阴性（Anti-Ctrl）对照转染SKOV3细胞相比：* P<0.05；
与单独金雀异黄素（GEN，40μM）处理的SKOV3细胞相比：#P<0.05；
与单独miR-199a-5p抑制物转染的SKOV3细胞相比：$ P<0.05（mean±SD，n=3）。
肿瘤细胞的葡萄糖有氧酵解也称为Warburg 效应，在维持肿瘤细胞生存和发展中起关键作用［1］。近来的研究表明miRNAs 可作为抑癌因子调节肿瘤细胞的糖酵解［7，8］。但是抑癌性miR-199a-5p 对卵巢癌糖酵解的作用仍不清楚。在本文的研究中，我们的结果与Li 等人［9］在肝细胞癌中的研究结果一致，miR-199a-5p 减少卵巢癌SKOV3 细胞乳酸产生和葡萄糖消耗，这些结果表明miR-199a-5p 抑制卵巢癌SKOV3 细胞的糖酵解。
金雀异黄素是在大豆和其他大豆产品中大量发现的一种异黄酮。我们先前的研究已经证明它能抑制卵巢癌的干性特征［3］，但金雀异黄素对卵巢癌SKOV3 细胞miR-199a-5p 表达及糖酵解的影响未见相关报道。在本文的研究中，我们率先发现亚细胞毒浓度的金雀异黄素不仅以浓度依赖趋势上调卵巢癌SKOV3 细胞miR-199a-5p 表达水平，并且能有效地抑制糖酵解。有趣的是，当我们用miR-199a-5p 抑制物联合金雀异黄素处理SKOV3 细胞，发现miR-199a-5p 抑制物能大部分消除金雀异黄素抑制SKOV3 细胞糖酵解作用，提示金雀异黄素可能通过上调miR-199a-5p 抑制卵巢癌SKOV3 细胞的糖酵解。然而金雀异黄素为何能调控卵巢癌细胞miR-199a-5p 表达及糖酵解有待进一步研究。
总之，我们的研究结果清楚的表明金雀异黄素能诱导卵巢癌SKOV3 细胞miR-199a-5p 表达以及抑制糖酵解。这为金雀异黄素抗卵巢癌作用提供了新实验参数和理论依据；
而且建议miR-199a-5p 有望成为靶向代谢特征治疗卵巢癌的一个新靶点。
