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曾佑成，周彦伦，曹国栋，林靓，郭立春，赵宇含，程青虹，3
(1.石河子大学医学院，石河子 832061；
2.南华大学医学院，衡阳 421200；
3.石河子大学医学院第一附属医院，石河子 832061)
脓毒症心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy，SIC)是由脓毒症导致的可逆性心功能障碍疾病，若不能得到及时有效的治疗，可导致患者死亡。由于其居高不下的病死率，SIC是研究者们重点关注的疾病之一[1-2]。目前，已知的脓毒症心肌功能障碍的机制包括循环中介质改变、细胞形态功能异常、线粒体功能障碍等[3]。近年来，铁死亡作为一种铁依赖性的新的细胞死亡形式，逐步走入研究者们的视野，已有研究表明它参与了心肌缺血-再灌注损伤、糖尿病心肌病、阿奇霉素诱导的心肌病等多种心血管疾病的发生[4-5]，但其在SIC中的发病机制、信号传导通路等尚未完全阐明。白藜芦醇是研究最多的具有二苯乙烯结构的多酚，主要存在于毛叶藜芦、虎杖、葡萄等植物中，具备免疫调节、抗氧化、抗炎等多种生物学效应，且具有心肌保护作用[6-8]。有研究发现白藜芦醇可以通过调节铁死亡影响疾病结局[9]。针对病因复杂的SIC，白藜芦醇具有多靶点和多环节的治疗优势，基于铁死亡探索白藜芦醇抗SIC的作用机制具有重要的意义。
1.1材料
1.1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠48只，6～8周龄，体质量(200±20)g。购自新疆医科大学动物实验中心[生产许可证编号：SYXK(新)2011-010101]，实验大鼠在石河子大学第一附属医院动物中心进行饲养[动物许可证编号：SYXK(新)2011-0002]，SPF级饲养环境下由专人添加食物与水，相对温度为20～25 ℃，相对湿度为50%～70%，室内通风良好，进食、饮水及笼内活动不设限。本实验的动物实验方案均得到石河子大学动物保护与使用委员会的批准(批号：A2018-018-01)。
1.1.2药物与试剂 白藜芦醇购自上海麦克林生物科技有限公司，批号：817263，含量≥99%；
Ex527(SIRT1抑制剂)购自上海罗恩试剂公司，批号：312666，含量≥98%；
SIRT1(货号：ab32441)、FTH-1(货号：ab183781)购自美国Abcam公司；
GPX4(货号：T56959)购自上海Abmart公司；
RIPA组织裂解液(货号：R0010)、Alexa Fluor 594标记的羊抗兔IgG荧光二抗(货号：K1034G-AF594)购自北京索莱宝生物技术公司；
DHE染色试剂盒(货号：D1008)购自苏州宇恒生物技术公司；
辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗(货号：GB23301)、山羊抗兔二抗(货号：GB23303)、抗β-actin抗体(货号：GB11001)均购自武汉赛维尔生物技术有限公司；
高敏型ECL化学发光检测试剂盒(货号：E412-01/02)均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(货号：A0202-2)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-myocardial band，CK-MB)试剂盒(货号：H197-1～2)、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(货号：A006-2-1)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(货号：A003-1～2)购自南京建成生物工程研究所；
铁离子比色法检测试剂盒(货号：E1042)购自北京普利莱生物公司。
1.1.3仪器 Z323K低温离心机(德国HERMILE公司)，多功能酶标仪Elx-800(美国Bio-Bad公司)，石蜡包埋机、轮转式切片机(德国LEICA公司)，光学显微镜(日本OPAGmpus公司)，全自动化学发光成像仪5200(中国上海天能公司)。
1.2方法
1.2.1分组与模型处理 48只SD大鼠适应性喂养1周后，按照体质量分层随机法分为假手术组、模型对照组、白藜芦醇组、Ex527组(每组12只)。模型对照组、白藜芦醇组、Ex527组采用盲肠结扎穿孔法制作大鼠脓毒症模型[10]，具体方法：术前禁食12 h，不禁水，麻醉后仰卧位固定。备皮，消毒后行腹中线切口，长度 1～1.5 cm，寻找到盲肠后，移出腹腔，在距根部1/4处用4号丝线结扎，用18号针对穿肠壁刺两次，挤出少量内容物，将肠管回纳入腹腔，使得肠内容物持续溢出，逐层关腹，术后立即皮下注射乳酸钠林格液 50 mL·kg-1，所有大鼠经静脉给予营养支持。假手术组小鼠用同样的方法处理，但不结扎和穿孔盲肠，不使用抗菌药物或类似物，术后大鼠放回笼中，禁止摄入食物，可以自由获得水。观察造模前和造模后大鼠的肛温、呼吸频率、心率、反应、饮食情况和有无竖毛、腹泻及出血等情况，评价模型是否成功。
1.2.2药物处理 选取造模成功大鼠纳入实验，模型对照组：采用盲肠结扎穿孔法制备SIC大鼠模型，术后0.5 h予以腹腔注射等同溶剂对照剂量的0.9%氯化钠溶液；
白藜芦醇组：CLP术后0.5 h予以腹腔注射白藜芦醇(50 mg·kg-1)；
Ex527组：CLP术前0.5 h腹腔注射Ex527(5 mg·kg-1)，术后0.5 h予以腹腔注射白藜芦醇(50 mg·kg-1)；
假手术组：术后0.5 h予以腹腔注射等同溶剂对照剂量的0.9%氯化钠溶液[11-13]。待术后各组大鼠实验观察点结束，即术后24 h后麻醉取腹主动脉血4 mL，3000 r·min-1离心15 min(离心半径6 cm)，取血清分装后存放于-80 ℃冰箱，用于后续检测。各组大鼠处死后，留取心脏标本，制作染色病理切片及用于后续检测。
1.2.3心肌组织苏木精-伊红(HE)染色 手术取出心脏组织后洗净残余血液，置于4%多聚甲醛缓冲液中固定保存48 h后行石蜡包埋，使用切片机将组织切片厚度5 μm，60 ℃烤片30 min进行脱蜡，水洗后行HE染色，梯度乙醇脱水，透明，滴加适量中性树胶后加盖玻片封片，待切片干燥后光学显微镜下观察并拍照保存。
1.2.4透射电镜观察 透射电子显微镜采用武汉赛维尔生物技术公司的标准程序进行。大鼠处死后3 min内取样，心脏组织取下后洗净切片面积2 mm×2 mm，投入电镜固定液内室温固定2 h，再转移至4 ℃冷藏保存运输。之后使用1%琼脂糖包埋细胞，脱水，用超微切片机切割成超薄切片(厚度70 nm)。切片用乙醇配制的醋酸铀染色15 min，然后用柠檬酸铅染色15 min。使用透射电子显微镜(HT7700，HITACHI)拍摄图像，每组至少拍摄图像5张。
1.2.5生化指标检测 取大鼠腹主动脉血3 mL离心血清，分别检测LDH和CK-MB的变化水平。通过研磨取左心室心肌组织匀浆上清液检测GSH和MDA的变化水平。操作步骤均按照对应试剂盒说明书方法操作。
1.2.6心脏组织铁离子浓度检测 采用亚铁嗪比色法定量检测铁离子浓度。心脏组织称质量后使用RIPA组织裂解液冰上裂解30 min。设置空白对照管、标准品管和样品管，加入铁离子检测剂30 μL，混匀，室温孵育30 min。样品在波长 550 nm 处读取吸光度(A值)，以标准曲线取值。
1.2.7DHE染色检测组织活性氧自由基(realtive axygen species，ROS) 采用新鲜组织冰冻切片进行DHE染色。取下心脏后，使用含乙醇-干冰的OCT化合物包埋心脏组织，待冰冻切片机至最佳切割温度，将其切成切片厚度5 μm，并置于载玻片上，储存在-80 ℃冰箱。在每个组织切片上滴加DHE(10 mol·L-1)，37 ℃避光湿盒中30 min，荧光显微镜观察和拍摄红色发射图像，ROS阳性细胞在整个核区被染成红色(激发波长为490 nm，发射波长为610 nm)。
1.2.8Western blotting检测心肌SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表达 心肌组织冰上研磨至匀浆，加入RIPA组织裂解液裂解30 min，12 000 r·min-1离心(离心半径6 cm)，取上清液，测定蛋白浓度。蛋白加上样缓冲液后煮沸上样，进行凝胶电泳，使用湿转法转膜后，BSA封闭液封闭2 h，使用SIRT1、GPX4、FTH-1(1：1000)4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min，对应二抗室温孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，滴加ECL发光液与膜作用后进行显影。
2.1HE染色心脏病理组织结果 见图1。大鼠心肌HE结果显示，24 h后所有假手术组大鼠心肌细胞排列整齐有序，未见明显异常。模型对照组心肌细胞水肿、变性，部分横纹肌模糊(黑色箭头所示)，间质纤维结构紊乱(红色箭头所示)，炎性细胞浸润(绿色箭头所示)。与模型对照组比较，白藜芦醇组偶见炎症细胞浸润，病理损伤程度明显减轻。而Ex527组损伤程度较白藜芦醇组明显加重。
A.假手术组；
B.模型对照组；
C.白藜芦醇组；
D.Ex527组。图1 4组大鼠心脏组织HE染色结果 A.sham group；
B.model control group；
C.resveratrol group；
D.Ex527 group.Fig.1 HE staining results of heart tissues in four groups of rats
2.2线粒体形态观察 见图2。铁死亡典型的形态学改变为细胞膜破裂伴随同质异形的小线粒体(嵴减少，膜凝聚，外膜破裂)[4]。图2中，假手术组心肌细胞线粒体膜和嵴结构清晰完整，排列整齐。与假手术组比较，模型对照组心肌线粒体结构出现外膜破裂、空泡样改变、嵴溶解断裂、肌纤维排列紊乱等改变。白藜芦醇组仍可见正常线粒体结构，仅小部分线粒体膜和嵴结构缺如。Ex527组类似模型对照组改变，可见线粒体膜凝聚、嵴减少。
A.假手术组；
B.模型对照组；
C.白藜芦醇组；
D.Ex527组。图2 4组大鼠心肌电子显微镜结果 A.sham group；
B.model control group；
C.resveratrol group；
D.Ex527 group.Fig.2 Electron microscopic results of myocardium in four groups of rats
2.3LDH、CK-MB检测结果 见图3。与假手术组比较，模型对照组大鼠血清中LDH和CK-MB均显著升高(P<0.01)，表明模型对照组大鼠心肌功能受损。造模后使用白藜芦醇腹腔注射，该组大鼠LDH和CK-MB均显著降低(P<0.01)。与白藜芦醇组比较，Ex527组LDH和CK-MB均显著升高(P<0.01)。
A.假手术组；
B.模型对照组；
C.白藜芦醇组；
D.Ex527组；
①与假手术组比较，t=10.71，26.60，P<0.01；
②与模型对照组比较，t=10.98，25.95，P<0.01；
③与白藜芦醇组比较，t，5.18～6.36，P<0.01。图3 4组大鼠血清中LDH、CK-MB水平A.sham group；
B.model control group；
C.resveratrol group；
D.Ex527 group；
①Compared with sham group，t=10.71，26.60，P<0.01；
②Compared with model control group，t=10.98，25.95，P<0.01；
③Compared with resveratrol group，t=5.18，6.36，P<0.01.Fig.3 LDH and CK-MB levels in the serum of rats in four
2.4GSH、MDA检测结果 见图4。与假手术组比较，模型对照组大鼠GSH含量显著降低，MDA含量显著升高(P<0.01)。与模型组比较，白藜芦醇组大鼠的GSH含量显著升高，MDA含量显著降低(P<0.01)。与白藜芦醇组比较，Ex527组GSH水平明显降低，而MDA明显升高(P<0.05)。
A.假手术组；
B.模型对照组；
C.白藜芦醇组；
D.Ex527组；
①与假手术组比较，t=11.13，17.83，P<0.01；
②与模型对照组比较，t=7.52，8.70，P<0.01；
③与白藜芦醇组比较，t=4.51，6.35，P<0.05。图4 4组大鼠心肌组织中GSH、MDA水平A.sham group；
B.model control group；
C.resveratrol group；
D.Ex527 group；
①Compared with sham group，t=11.13，17.83，P<0.01；
②Compared with model control group，t=7.52，8.70，P<0.01；
③Compared with resveratrol group，t=4.51，6.35，P<0.05.Fig.4 GSH and MDA levels in myocardial tissue of rats in four
2.5铁离子浓度检测结果 见图5。与假手术组比较，模型对照组大鼠心肌细胞中铁离子含量显著升高(P<0.01)。在使用白藜芦醇干预后，该组大鼠铁离子含量显著降低(P<0.01)。与白藜芦醇组比较，Ex527组铁离子含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
A.假手术组；
B.模型对照组；
C.白藜芦醇组；
D.Ex527组；
①与假手术组比较，t=13.20，P<0.01；
②与模型对照组比较，t=6.59，P<0.01；
③与白藜芦醇组比较，t=2.74，P<0.05。图5 4组大鼠心肌组织铁离子浓度 A.sham group；
B.model control group；
C.resveratrol group；
D.Ex527 group；
①Compared with sham group，t=13.20，P<0.01；
②Compared with model control group，t=6.59，P<0.01；
③Compared with resveratrol group，t=2.74，P<0.05.Fig.5 Concentration of iron ions in myocardial tissue of rats in four groups
2.6检测组织ROS结果 见图6。与假手术组比较，模型对照组大鼠心肌ROS表达显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较，白藜芦醇组ROS表达受到抑制(P<0.01)。在使用Ex527之后，ROS表达水平明显升高(P<0.05)。
A.假手术组；
B.模型对照组；
C.白藜芦醇组；
D.Ex527组；
①与假手术组比较，t=12.21，P<0.01；
②与模型对照组比较，t=14.41，P<0.01；
③与白藜芦醇组比较，t=8.94，P<0.05。图6 4组大鼠心肌ROS染色结果(×400) A.sham group；
B.model control group；
C.resveratrol group；
D.Ex527 group；
①Compared with sham group，t=12.21，P<0.01；
②Compared with model control group，t=14.41，P<0.01；
③Compared with resveratrol group，t=8.94，P<0.05.Fig.6 ROS staining results of rat myocardium in four groups(×400)
2.7Western blotting实验结果 见图7。与假手术组比较，模型对照组大鼠心肌中SIRT1、GPX4、FTH-1显著降低(P<0.05)。与模型对照组比较，白藜芦醇给药组能显著提高SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表达水平(P<0.05)。在使用Ex527之后，SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表达水平明显减少(均P<0.05)。
A.假手术组；
B.模型对照组；
C.白藜芦醇组；
D.Ex527组；
①与假手术组比较，t=16.48，7.32，3.80，P<0.05；
②与模型对照组比较，t=13.75，9.84，5.03，P<0.05；
③与白藜芦醇组比较，t=7.74，4.90，6.17，P<0.05。图7 4组大鼠心肌组织SIRT1、GPX4、FTH-1蛋白表达水平 A.sham group；
B.model control group；
C.resveratrol group；
D.Ex527 group；
①Compared with sham group，t=16.48，7.32，3.80，P<0.05；
②Compared with model group，t=13.75，9.84，5.03，P<0.05；
③Compared with control resveratrol group，t=7.74，4.90，6.17，P<0.05.Fig.7 Expression levels of SIRT1，GPX4 and FTH-1 protein in myocardial tissue of rats in four groups
SIC是严重脓毒症常见的并发症，其发病机制的复杂性增加了临床治疗的难度，目前仍没有有效的治疗方式来早期干预 SIC 的进展[14-15]。铁死亡作为一种新的细胞死亡方式，有研究表明铁蛋白自噬参与的铁死亡介导了SIC的发生[16]。铁死亡在形态学、遗传学和生物化学等方面均不同于以往的细胞凋亡、焦亡或坏死等细胞死亡方式，它受多种代谢途径调控，有两大特征：一是铁依赖性，各种原因所致细胞内亚铁离子增多可致ROS生成增加，进一步与细胞内蛋白、核酸等发生反应；
二是脂质过氧化物过度累积，当细胞内抗氧化系统(Cystine/GSH/GPX4)活性下调后，多不饱和脂肪酸长链与过多的ROS反应，生成丙二醛(malondialdelyde，MDA)、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)等氧化产物，最后造成细胞膜破裂[17-19]。本研究采用线粒体形态学观察、铁死亡标志物检测、过氧化产物测定，多类别多层次证实铁死亡是SIC的发生机制之一，并进一步研究了天然多酚类药物白藜芦醇通过SIRT1/GPX4通路途径提供心肌保护作用。
白藜芦醇可通过抗炎、抗氧化、调控免疫、凋亡等多种生物途径改善不同类型的心肌病变，进而对心血管系统起到保护作用。白藜芦醇被认为是强有力的羟基自由基、超氧化物和金属诱导基团的分子清除剂，可减轻ROS引起的细胞膜脂质过氧化和DNA损伤[20]。研究发现，通过白藜芦醇膳食干预可逆转肝病小鼠中的FoxO1的乙酰化，增加SIRT1水平，减轻铁代谢异常所致肝损伤和慢性肝病发展[21]。MO等[22]用聚合纳米颗粒封装白藜芦醇，其良好的生物相容性提高了白藜芦醇的生物利用度，结果表明封装后的白藜芦醇能够抑制由erastin诱导的HT22小鼠海马细胞的铁死亡，但LEE等[23]在头颈部肿瘤的上皮-间充质转化研究中，使用SIRT1基因沉默或Ex527药物处理可减轻细胞铁死亡，从而抑制肿瘤的上皮间充质转化，使用白藜芦醇和SIRT诱导剂SRT1720可增加细胞铁死亡。目前的研究并未完全阐明白藜芦醇对铁死亡的调控机制，因此本研究构建SIC大鼠模型，并在该模型中进一步探究白藜芦醇在铁死亡进展过程中所扮演的角色。此外，白藜芦醇是SIRT1的天然激动剂[24]，SIRT1作为依赖NAD+的去乙酰化酶，能修饰转录因子和DNA修复蛋白等在内的50多个非组蛋白靶标，在维持组织的代谢平衡中发挥着重要功能，已被证明在脓毒症所致的肝、肾、脑等多脏器功能障碍中起到保护作用[25-27]。在该SIC模型中，与假手术组比较，模型组SIRT1蛋白表达显著减少，但是在CLP术后予以白藜芦醇处理后，SIRT1蛋白表达增加，铁死亡信号降低，心脏损伤程度也得以减轻。此外，在使用SIRT1的特异性抑制剂Ex527预处理大鼠后，白藜芦醇对大鼠SIC的保护作用明显减弱，这也证实SIRT1激活参与白藜芦醇对大鼠SIC的保护机制，这可能与SIRT1能抑制铁死亡通路相关。
谷胱甘肽过氧化酶-4(GPX4)在铁死亡进展过程中起重要作用，它的失活可导致脂质过氧化物的积累并导致铁死亡[28]。铁重链蛋白-1(FTH-1)表达降低说明细胞内铁离子储存减少，而增多的铁离子可能通过芬顿反应产生ROS，进而影响正常的细胞代谢活动。因此，GPX4和FTH-1可以一定程度上反映心肌组织铁死亡的程度。本研究中，CLP模型组心肌GPX4、FTH-1蛋白表达均受到抑制，铁死亡的相关信号——GSH消耗、ROS增加、脂质过氧化也都被观察到，这与参考文献[29-30]中的结果一致。此外在实验过程中，CLP模型组予以白藜芦醇腹腔注射后，铁死亡相关的信号受到抑制，线粒体损伤明显减轻。之后使用SIRT1抑制剂(Ex527)阻断SIRT1信号表达，大鼠的心脏铁死亡程度增加，心肌损伤明显加重。以上结果表明，铁死亡参与了SIC的进展，且白藜芦醇引起的SIRT1的激活可使GPX4蛋白表达水平明显上升，起到抑制铁死亡，减少心肌损伤的作用。
综上所述，白藜芦醇可以通过调节SIRT1/GPX4信号通路抑制心肌铁死亡，改善CLP诱导的SIC，其分子机制可能与上调GPX4蛋白表达、减少ROS积累，减轻线粒体损伤有关。本研究也存在一定局限性，第一，上述讨论机制可能是白藜芦醇对大鼠SIC的治疗作用的一方面，与其他细胞死亡死亡形式，如自噬、凋亡、焦亡等协同作用值得深入研究；
第二，未使用细胞或者基因敲减等方法进一步验证加强证据链，是否存在其他的中间调控靶点参与SIRT1对铁死亡的调控也需进一步阐明。
