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巩佳琦，赵佳宁，王延鸿，杜俊杰，吕光耀，王洪波，凌龙兵
(烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心，长效和靶向制剂国家重点实验室，烟台 264005)
基于细胞膜的仿生纳米递药系统因其良好的生物相容性和低免疫原性已成为研究热点。利用机体内生物膜，如红细胞、免疫细胞、肿瘤细胞和干细胞，对功能化纳米载体进行仿生修饰，有效地将天然生物膜“自体”属性和“人工”纳米载体的优势结合，极大地提高了纳米药物生物相容性，降低免疫原性，延长血液循环时间；
同时，由于膜结构的包裹，也可以减少递送过程中的药物渗漏，一定程度上降低药物毒性，提高了治疗的有效性。本文根据纳米药物和细胞膜仿生技术在肿瘤精准医疗领域的研究进展，总结膜仿生纳米药物技术的实验基础并分类介绍膜仿生纳米递药系统的构建以及在肿瘤靶向治疗上的应用，进一步探讨细胞膜仿生纳米技术在临床应用中所面临的机遇
1.1膜仿生纳米药物制备 膜仿生纳米药物的制备方法主要有自上而下和微流控电穿孔两种方式，且自上而下方式是制备膜仿生纳米药物的常用方法，主要包括细胞膜提取和膜与纳米载体融合两步骤[1]。其中，红细胞、白细胞、血小板这类血细胞由全血中分离得来；
中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞等免疫细胞主要由骨髓中提取获得；
肿瘤细胞由对应细胞传代培养获得；
干细胞一般由动物组织中获取。收集到纯化的细胞后，将细胞经过低渗处理或反复冻融，然后通过高速离心的方法去除细胞内容物，以获取细胞膜碎片。利用多孔聚碳酸酯膜挤出制备细胞膜衍生囊泡，进一步将上述细胞膜衍生囊泡与纳米载体共挤出获得膜仿生核-壳纳米药物。虽然共挤出法是一种简单有效的方法，但不适合大规模生产，是细胞膜治疗技术走向临床实际应用的重大障碍。现阶段，有一些研究者利用超声法制备膜仿生纳米药物。超声法主要是将膜囊泡与纳米载体在超声下共孵育，使膜囊泡对内核载体进行包裹。过程中，超声频率、时间、超声强度对所形成的仿生纳米药物外观均匀性、药物载药量等参数具有重要影响。类似地，超声法制备的仿生纳米药物通常分布不均，且局部高温可能会造成膜蛋白变性。随着微流控技术的发展，基于微流控芯片的电穿孔技术因可实现高度重复和高通量制备膜仿生纳米药物而备受关注[2]。微流芯片系统由五部分组成：进样口、Y型合并通道、S型混匀通道、电穿孔区和出样口。膜囊泡和纳米载体分别通过进样口进入系统后，在Y型通道合并，S型通道混合。经电穿孔区的电脉冲作用，完成膜囊泡对纳米载体内核的包覆。通过对脉冲电压、持续时间以及流速等参数的微调，可以得到包覆性好、稳定性高的纳米颗粒，但是这种装置的成本相对共挤出和超声法高。
1.2膜仿生纳米药物表征 膜仿生纳米药物制备完成后需要对其物理化学性质进行表征，以获得最佳制备效果。通过检测膜修饰纳米药物前后的粒径、电位和形态等基本参数的变化，用以反馈调节制备流程，提高膜仿生纳米药物的产率。此外，需检测细胞膜修饰后纳米药物的生物学功能，主要包括特异性蛋白和标记物的保留情况以及纳米药物安全性、药物释放和治疗效果[3]。透射电子显微镜(TEM)是常见的检测纳米药物形貌和膜包覆效率的仪器，其分辨率可达0.1～0.2 nm。膜仿生纳米药物能够在磷钼酸或醋酸双氧铀负染后呈现典型的双层的纳米颗粒图像，进而分析膜仿生纳米药物的粒径和计算样品中膜包覆纳米药物的比率。动态光散射(DLS)技术作为纳米粒径分布和Zeta电位检测的基本方法，可评估细胞膜修饰的粒径和Zeta电位的变化。通常，膜仿生纳米药物的平均尺寸会增加膜磷脂双分子层厚度10～20 nm，Zeta电位为表面包覆细胞膜囊泡电位。最后利用SDS-PAGE 凝胶电泳、蛋白质印迹(Western blotting)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫荧光等表征手段检测膜包覆纳米药物的生物学功能及膜表面蛋白标志物。由于机体生物膜来源、膜修饰原理、纳米载体功能和负载药物不同，上述的表征方法应根据体系区别设计专属实验验证纳米递药系统的结构与性能。
不同类型的细胞膜能够赋予纳米药物不同的运输机制和独特的生物学功能，从而增强药物的抗肿瘤作用。例如，红细胞能够延长纳米药物血液循环时间，减少网状内皮系统对其清除；
免疫细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞等，可促进纳米药物免疫逃避、针对炎症或肿瘤位点的特异性靶向，实现肿瘤的靶向治疗；
肿瘤细胞膜继承了源细胞同源靶向和抗原库的功能，可用于高度特异性的肿瘤精准治疗和免疫治疗。本文以细胞膜为标准，分类总结近年来细胞膜仿生纳米递药系统在肿瘤治疗领域的研究。此外，进一步介绍了混合细胞膜制备仿生纳米递药系统的研究性进展。
2.1红细胞膜仿生纳米递药系统 基于红细胞的仿生修饰是目前纳米递药系统研究最为成熟的表面改性之一[4]。红细胞是机体血液中含量最多、寿命最长的血细胞，体内循环时间可达100～120 d。由于其表面特殊的多糖及蛋白(CD47)结构，红细胞能够穿透心脑血管系统和正常组织而不被网状内皮系统识别吞噬；
且成熟的红细胞细胞内容物少、遗传背景简单，易于实现膜分离提取，因此红细胞膜仿生纳米递药系统在肿瘤治疗领域极具开发前景。此外，膜磷脂层的流动性为赋予红细胞表面肿瘤靶向性及功能化提供可能。
2011年，HU等[5]首次采用自上而下方法将红细胞膜和PLGA微球共挤出制备红细胞膜仿生纳米递送系统。研究表明，该体系完整保留红细胞膜的功能性，在裸鼠模型中其血液循环半衰期t1/2可达39.6 h，显著优于传统PEG修饰纳米药物的循环半衰期(t1/2=15.8 h)。此方法开辟了利用生物膜改善纳米载体生物相容性的新思路。近年来，仿生红细胞技术和光热治疗、免疫治疗相结合来靶向治疗恶性肿瘤。YANG等[6]利用红细胞膜修饰含NIR II 光热剂 (IR1061) 和1-甲基色氨酸(IDO-1抑制剂)的热敏一氧化氮供体PAAV-SNO聚合物，构建了具有调控肿瘤微环境(TME)特性的纳米递药系统。体内外实验结果显示，这种多功能纳米药物在动物体内长循环靶向富集于肿瘤部位并在NIR II激光照射下，实现药物的可控释放。更重要的是，光热疗法局部高温可激发肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(ICD)，募集肿瘤部位 CD8+T 淋巴细胞。同时通过1-甲基色氨酸干扰 IDO-1 活性和原位产生的一氧化氮(NO)使肿瘤血管正常化，编程TME免疫刺激表型，最终获得对原发性和转移性乳腺癌的实验性治疗。
目前，赋予纳米药物主动靶向的基本策略是对其表面进行化学修饰，但可能会破坏红细胞膜的完整性。鉴于此，有研究开发了一种脂质插入技术以实现红细胞膜的功能化。FANG等[7]首先将叶酸(FA)与二硬脂酰磷酸乙醇胺脂质(DSPE)偶联，而后插入红细胞膜中。纳米载体被这些配体功能化的红细胞膜包裹后，在体外和体内的肿瘤模型中均获得了主动靶向能力。综上所述，红细胞仿生纳米递药系统解决了传统纳米药物的生物相容性差、强免疫原性等缺点，可能为临床药物转化提供技术支持。但在进一步的发展和转化中也面临新的挑战，如红细胞的离体保存，在整个保存过程中均需防止污染，及红细胞的应用要充分考虑血型匹配原则。
2.2免疫细胞膜仿生纳米递药系统 慢性炎症是肿瘤发生的主要病理特征。在此过程中，中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱性粒细胞和NK细胞、T 细胞及 B 淋巴细胞等一系列炎症细胞参与肿瘤进展，同时肿瘤细胞会过度表达各种细胞因子和趋化因子来招募各类免疫细胞[8]。因此，可以考虑利用二者表面抗原-抗体的相互识别作用，构建免疫细胞膜仿生递药系统于抗肿瘤药物的靶向递送。
巨噬细胞作为一种非特异性免疫细胞，可以吞噬和降解侵略性的外来物质，靶向于肿瘤炎症微环境，并通过肿瘤表面抗原特异性作用促进纳米药物与肿瘤细胞的结合。PARODI等[9]利用巨噬细胞膜包覆纳米多孔硅颗粒。巨噬细胞膜上的CD45、CD11c蛋白和聚糖多功能分子有利于防止纳米药物被吞噬和消除，显著改善体内循环时间和肿瘤部位的累计。在此基础上，该课题组进一步验证了巨噬细胞膜和肿瘤血管内皮受体ICAM-1之间的相互作用，使之增强纳米药物对肿瘤血管系统的粘附性，促进药物在肿瘤部位的富集[10]。此外，由于巨噬细胞与肿瘤的发展和转移有关，其仿生细胞膜的修饰可以促进载体与肿瘤细胞的粘附，实现药物的转移靶向。4T1荷瘤小鼠的体内荧光成像证实了巨噬细胞膜包裹脂质体在给药48 h后仍蓄积在肿瘤组织，且提高了纳米载体转移靶向作用，有效抑制乳腺癌肺转移。
中性粒细胞是哺乳动物体内最重要的一种白细胞，可通过黏附因子(LFA-1-ICAM-1、L-选择素-CD44 和 β1 整合素VCAM-1 相互作用)与循环肿瘤细胞(CTC)相互作用，准确地靶向迁移到肿瘤炎症部位和血液中循环的肿瘤细胞，具趋化性。受此机制启发，KANG等[11]研究发现，包被有中心粒细胞膜的 PLGA 可以靶向恶性黑色素瘤，在鼠黑素瘤细胞系 B16F10 中显示出明显增强的细胞毒性。除了优异的肿瘤炎症靶向性，中性粒细胞被证明能够穿透血脑屏障来治疗脑胶质瘤[12]。XUE等[13]构建了中性粒细胞膜修饰的负载紫杉醇脂质体纳米粒，用于脑胶质瘤的术后防复发治疗。手术切除小鼠脑胶质瘤后，在其伤口部位会产生丰富的炎症因子，这些炎症因子会诱导中性粒细胞仿生纳米粒穿透血脑屏障到达肿瘤位置，后将负载药物释放到肿瘤部位发挥抗肿瘤作用。
此外，其他代表性的免疫细胞，如T细胞、NK细胞膜也用于仿生纳米递药系统的制备。作为一种重要的淋巴细胞，T细胞参与机体细胞免疫反应，且可以靶向杀伤肿瘤细胞，在癌症治疗中具有应用潜力。最近报道了一种基于细胞毒性T细胞膜负载紫杉醇的仿生递药系统TPNP，并对TPNP进行局部低剂量辐射处理[14]。细胞毒性T淋巴细胞膜可有效增长TPNP纳米药物的体内循环时间；
经辐射处理后，诱导T淋巴细胞膜包裹的TPNP靶向胃癌微环境，触发紫杉醇的释放，协同抑制胃癌进展。该研究为T细胞膜修饰纳米粒构建递药系统提供了可行性[14]。除可用于靶向化疗外，T细胞介导的免疫治疗在肿瘤治疗领域也引起了广泛的关注[15]。NK细胞是一种颗粒状淋巴细胞，通过异常表达细胞和主要组织相容性复合体1 (MHC-1)分子标记物来保护宿主抵抗癌细胞。装载在NK-MPEG-PLGA NPs中的TCPP通过PDT抑制原代肿瘤细胞增殖，同时触发垂死的肿瘤细胞产生免疫原性细胞死亡(ICD)，激活抗原提呈细胞(APCs)。在近红外光的照射下，Ce6发生能级跃迁，实现对肿瘤的光热/光动力协同治疗。同时 NK 细胞膜还有免疫激活功能，最终获得对肺癌的实验性治疗[16]。
2.3肿瘤细胞膜仿生纳米递药系统 肿瘤细胞具有无限增殖的能力，很容易通过体外培养获得，这为大量肿瘤细胞膜的收集奠定了来源基础。肿瘤细胞膜能够赋予纳米粒免疫逃逸性质，从而延长血液循环时间。同时，肿瘤细胞膜还继承了源细胞同源靶向和抗原库的功能，这些功能主要归因于膜表面的蛋白，包括N-钙粘蛋白，半乳糖凝集素-3 和上皮细胞粘附分子，可用于高度特异性的肿瘤靶向治疗和免疫治疗[17]。研究显示，HepG-2肿瘤细胞膜修饰负载多柔比星PLGA纳米粒与单纯纳米粒相比，同源肿瘤细胞对其摄取量显著增强。在体内携带HepG2的异种移植小鼠模型中，由于血液循环延长和免疫逃逸，仿生PLGA纳米药物表现出良好的抗肿瘤作用和较低的体内毒性[18]。近年来，基于肿瘤微环境构建刺激响应型肿瘤细胞膜仿生纳米粒的研究受到了人们越来越多的关注。LIU等[19]报道了一种前列腺癌LNCaP-AI细胞膜包被负载多柔比星的二氧化硅纳米粒(Dox/MSN@CaCO3@CM)，内嵌CaCO3则作为药物pH控释的开关层。与游离Dox相比，所得纳米药物Dox/MSN@CaCO3@CM可以有效的靶向内化至LNCaP-AI 前列腺细胞；
在酸性pH作用下，CaCO3层分解进而响应释放负载Dox，诱导更高的细胞凋亡。体内抗肿瘤结果显示，该纳米药物显著抑制肿瘤生长。
2.4杂化细胞膜仿生纳米递药系统 鉴于来自不同类型细胞的细胞膜具有特定的特性，越来越多的研究将两种不同来源的细胞膜融合来构建杂化膜仿生纳米递药系统，以放大两种源细胞的特性。DEHAINI等[22]利用红细胞和血小板混合膜包覆纳米粒，获得杂化膜纳米粒。由此产生的双膜包被纳米粒与单膜红细胞包被纳米粒和血小板包被纳米粒相比，该纳米粒在小鼠模型中表现出良好的长循环和分布的交叉杂化膜特征，且具有良好的生物相容性，为多功能性细胞仿生药物递送平台的构建提供了新的技术支持。WANG等[23]开发了红细胞-黑色素肿瘤细胞杂化膜，并将杂化膜修饰载有多柔比星的CuS纳米粒(DCuS@[RBC-B16]NPs)用于黑色素瘤的化疗/光热联合治疗。结合光热特性和两个源细胞的固有特性，DCuS@[RBC-B16]NPs表现出长时间血液循环和肿瘤靶向性，对黑色素瘤肿瘤生长抑制率近100%。此外，杂化膜包括血小板-白细胞杂化膜仿生纳米粒、红细胞-巨噬细胞杂化膜仿生纳米粒及肿瘤干细胞-血小板杂化膜仿生纳米粒在肿瘤的治疗上也备受青睐，有助于不同肿瘤的个性化治疗[3]。
2.5其他类型膜仿生纳米递药系统 干细胞是一种具有低免疫原性和自我复制能力的多功能细胞，已被证实能够靶向肿瘤细胞并追踪浸润的肿瘤细胞，例如间充质干细胞(MSC)、神经干细胞和造血干细胞，均显示出肿瘤归巢能力。MSC的这些独特特性主要归因于不同膜上的各种受体，如细胞因子受体(ILR1、ILR3、ILR4、TNFR和IFN γR)，生长因子受体(TGF-β、HGF)，细胞基质受体(CD44、Integrins)，趋化因子受体(CXCR、CCR)和细胞-细胞相互作用受体(Notch、ICAM和VAM1)[24-25]。鉴于MSC膜上的配体和受体，干细胞结合NPs治疗不仅可以复制干细胞的复杂功能，还可以保持NPs核心的纳米级和载药特性。因此，干细胞膜包被的NPs由于其固有的嗜肿瘤和炎症迁移特性，在抗肿瘤治疗中具有很高的应用潜力。MU课题组[26]通过低渗处理的方式提取间充质干细胞膜，并用其包覆携带siRNA的氧化铁纳米粒子，用于肿瘤的光热/基因协同治疗。
实验结果表明， 所得纳米药物能够靶向递送siRNA至小鼠皮下移植瘤部位，并引发癌细胞发生凋亡。结合纳米氧化铁的光热治疗效果，该纳米药物起到了较好的抗肿瘤效果。
外泌体是由各种类型的细胞分泌的纳米级(30～120 nm)膜囊泡，可有效地将携带的蛋白质等生物活性物质转运到靶细胞并被靶细胞接收，从而诱导细胞反应。此外，外泌体具有免疫原性低和较好的包载能力[27]。受这些优势的启发，外泌体有被设计成治疗肿瘤的纳米载体的潜能。研究表明，与人工化学递送载体相比，外泌体的脂质和蛋白质组成以及其他天然成分在提高生物利用度和减少不良反应方面等发挥着重要作用，且外泌体能以最小的免疫清除率被靶细胞摄取，重复注射耐受性良好。基于这些特征，外泌体在肿瘤诊断和治疗中的应用范畴日益扩大。YONG等[28]开发了一种生物相容的肿瘤细胞胞吐外泌体仿生多孔硅纳米颗粒(PSiNPs)，用于递送Dox靶向治疗肿瘤。外泌体包被负载Dox的 PSiNPs (DOX@E-PSiNPs)纳米粒由肿瘤细胞内吞DOX@E-PSiNPs的胞吐作用产生。在皮下、原位和转移性小鼠肿瘤模型中，DOX@E-PSiNPs表现出增强的肿瘤积累、血管外渗和渗透到肿瘤深部的作用，具有明显的抑瘤效果。
外泌体作为一种独特类型的纳米载体，无法实现高负载能力，临床转化仍面临一定的挑战。此外，外泌体的表面修饰、纯化和作用机制研究有待进一步深入，这将有助于提高外泌体的生物安全性评价。
本文重点介绍了基于细胞膜的仿生纳米递药系统的研究进展及其在肿瘤治疗中的应用。来自不同源细胞的膜可以直接赋予纳米载体多种生物学功能，而无需复杂的合成设计。相对于其他药物递送系统，通过细胞膜包被可以降低纳米药物免疫原性，避免被内皮网状系统清除，延长药物在血液中的循环时间。此外，被巨噬细胞、干细胞和癌细胞膜包裹的仿生纳米药物保留了其天然的肿瘤归巢能力，能够克服生理屏障，主动靶向和渗透肿瘤部位，对原发肿瘤和转移性肿瘤治疗具有重要意义。根据疾病属性，纳米粒的细胞膜包被技术创新性地将不同纳米材料和不同细胞膜灵活融合，在药物靶向递送、肿瘤治疗和和免疫调节等众多领域具有广阔的应用前景。
然而，细胞膜仿生纳米递药系统仍处于起步阶段，很难转化为临床试验。首先，细胞提取和纯化方法尚未成熟。某些类型的细胞寿命较短，难以实现规模化膜提取；
其次，细胞膜上有许多不同种类的蛋白质，需要识别出具有特定作用的重要蛋白质，并按照可接受的标准消除不需要的蛋白质。现阶段仿生纳米粒表征手段有限，膜包被的成功仅通过粒度检测和形态观察来验证。蛋白质印迹分析只能证明膜仿生纳米药物的表面组成与源细胞膜的表面组成是否相似，但未能验证膜包被后细胞膜是否被部分破坏。此外，本文中报道的大多数研究主要是在小鼠模型中进行测试的，有必要评估其在人类机体中的免疫原性。面临细胞膜仿生纳米药物的大规模工业生产和质量控制的挑战，需建立膜提取、蛋白表征和复合纳米粒制备的可控性、使用安全性和有效性标准方案。
展望未来，尽管从实验室到临床应用仍有许多问题需要解决，但细胞膜仿生纳米药物的天然优势和应用潜能不可否认。相信随着仿生纳米技术的创新研究和发展，膜仿生药物递送系统必将推动肿瘤的精准医疗迈入新的阶段。
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