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张梦杰，刘俊丽，杨 娜，杨 玲，韩继明*
（1.延安大学医学院，陕西 延安 716000；
2.空军军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032）
层粘连蛋白是基底膜的重要组成部分，对调控肿瘤的黏附和迁移具有重要作用［1］。层粘连蛋白332（Laminin 332，LM332）是层粘连蛋白中研究最多的亚型，包含α3、β3和γ2［2］。α3亚基由基因层粘连蛋白3（Laminin subunit alpha3，LAMA3）编码，该基因变异会影响LM332异源三聚体的组装，进而影响层粘连蛋白的生物活性［3］。并且在前列腺癌患者中LAMA3基因表达沉默，在卵巢癌患者中LAMA3基因表达低于正常组织［4］。此外，研究［5-6］证明LAMA3基因在鳞状细胞癌中的高度表达可能与肿瘤的侵袭性增加有关。尽管LAMA3与肿瘤之间的关系得到广泛的关注，但是在多种肿瘤预后及免疫微环境调控中的作用目前仍不清楚。本研究首先分析LAMA3在泛癌中的表达水平；
其次研究LAMA3在泛癌中的预后价值；
然后分析其与肿瘤浸润免疫细胞（tumor-infiltrating immune cell，TIIC）、肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）和微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）之间的相关性，并进行免疫基因共表达分析。
1.1 LAMA3在泛癌中的差异表达
通过基因型和基因表达量关联数据库（The Genotype-Tissue Expression，GTEx）、肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库、以及癌症细胞系百科全书（The Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）获取泛癌数据并提取相应的临床信息，使用R包中的RMA功能，过滤整个数据，删除缺失和重复的结果，并通过log2（TPM+1）进行转换。
1.2 LAMA3表达与泛癌患者预后的相关性分析
预后分析数据从TCGA数据库和国际肿瘤基因组联盟（The International Cancer Genome Consortium，ICGC）数据库下载，分析了LAMA3在33种肿瘤中的表达与总生存率（overall survival，OS）的关系。根据LAMA3表达值的中位值，将患者分为LAMA3高表达组和低表达组后，采用Kaplan-Meier法绘制各肿瘤患者的生存曲线。
1.3 LAMA3表达与泛癌中肿瘤浸润免疫细胞的相关性分析
LAMA3表达与泛癌免疫浸润细胞的相关性通过肿瘤免疫估计资源2.0（TIMER2.0；
//http：//timer.cistrome.org/）数据库进行分析。
1.4 LAMA3表达与TMB和MSI之间的相关性分析
从TCGA数据库下载泛癌的TMB和MSI信息，TMB计算的是每种肿瘤中每百万碱基对的总突变率，MSI计算的是每百万碱基对重复序列缺失或插入的总发生率。使用“cor.test”命令分析LAMA3与TMB及MSI的相关性，并绘制雷达图。
1.5 LAMA3与免疫检查点基因的共表达分析
LAMA3表达与免疫检查点基因的共表达分析采用R包的“limma”进行，并通过R包绘图。
1.6 统计学方法
采用Wilcox秩和检验分析泛癌中LAMA3的表达差异。采用对数秩检验评估预后分析Kaplan-Meier曲线之间的差异。采用Spearman检验评估LAMA3表达与免疫细胞浸润评分、TMB和MSI之间的相关性。采用Person检验评估LAMA3表达与免疫基因表达之间的相关性。采用R软件（版本4.1.0）进行统计分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。所有图表均通过R包“ggplot2”和“forestplot”绘制。
2.1 泛癌中LAMA3 mRNA表达的差异
本研究首先分析了LAMA3在正常人不同组织中mRNA的表达水平，结果表明LAMA3在31种正常组织中表达且表达水平差异较大，在血液和脊髓中几乎不表达，在肺、子宫和阴道中的表达水平最高，在其它组织中的表达水平接近（图1A）。并且LAMA3仅在21种肿瘤细胞系中表达，与正常组织的表达范围相比较窄（图1B）。与癌旁组织相比，LAMA3在浸润性乳腺癌（invasive breast cancer，BRCA）、结肠癌（colon adenocarcinoma，COAD）、胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）、子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）中显著低表达，而在胆管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）、食 管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、肝细胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）中显著高表达（图1C）。结合TCGA和GTEx数据库的泛癌数据进行分析，27种肿瘤中有22种表达差异显著。与正常组织相比，LAMA3在BRCA、GBM、脑低级别胶质瘤（brain lower grade glioma，LGG）、LUAD、卵巢浆液性囊腺癌（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）、PRAD、皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）、睾丸生殖细胞肿瘤（testicular germ cell tumors，TGCT）、甲状腺癌（thyroid carcinoma，THCA）、UCEC、子宫癌肉瘤（uterine carcinosarcoma，UCS）肿瘤组织中显著低表达，而在CHOL、COAD、ESCA、HNSC、肾嫌色细胞癌（akidney chromophobe，KICH）、KIRC、KIRP、急性髓细胞样白血病（acute myeloid leukemia，LAML）、LIHC、PAAD、STAD肿瘤组织中显著高表达（图1D）。
图1 LAMA3在各种组织和肿瘤中的表达水平
2.2 LAMA3表达与泛癌患者预后的相关性分析
本研究进一步分析了LAMA3与泛癌患者预后OS之间的关系。Kaplan-Meier生存曲线显示，LAMA3高表达与6种肿瘤预后不良密切相关，包括膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）（OS：P＜0.05）、宫颈鳞癌和腺癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）（OS：P＜0.05）、HNSC（OS：P＜0.05）、LAML（OS：P＜0.000 1）、LUAD（OS：P＜0.000 1）和PAAD（OS：P＜0.000 1）（图2）。
图2 LAMA3与泛癌预后显著相关的Kaplan-Meier生存曲线
2.3 LAMA3表达与肿瘤浸润免疫细胞的相关性分析
本研究通过TIMER2.0分析了泛癌中LAMA3表达与肿瘤浸润免疫细胞的相关性。结果显示LAMA3与多种免疫细胞浸润程度呈正相关，包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润评分，其中显著相关性最高的肿瘤类型分别为COAD、PRAD、SKCM（图3），表明LAMA3的高表达可能与免疫细胞增加的浸润水平有关。
图3 LAMA3 mRNA表达与TIIC的相关性
2.4 LAMA3表达与TMB和MSI的相关性分析
在肿瘤的研究中，TMB和MSI都是有效的预后预测标志物和免疫治疗反应指标。本研究进一步探讨了LAMA3表达与TMB和MSI之间的关系，结果显示LAMA3表达与11种肿瘤的TMB存在显著相关性，与BLCA（P＜0.05）、BRCA（P＜0.05）、CESC（P＜0.05）、DLBC（P＜0.05）、HNSC（P＜0.05）、LGG（P＜0.05）、PRAD（P＜0.05）、SKCM（P＜0.05）、THCA（P＜0.05）呈负相关；
与PAAD（P＜0.05）、THYM（P＜0.05）呈正相关（图4A）。其中DLBC系数值最低，THYM系数值最高，说明LAMA3表达与DLBC的低突变状态呈正相关，与THYM的高突变状态呈正相关。LAMA3表达与MSI相关性分析表明，有6种肿瘤的MSI与LAMA3表达水平存在显著相关性，如DLBC（P＜0.05）、GBM（P＜0.05）、HNSC（P＜0.05）、LGG（P＜0.05）、LUSC（P＜0.05）、SKCM（P＜0.05）。其中LAMA3表达与GBM、LUSC和LGG呈正相关，与DLBC、HNSC和SKCM呈负相关（图4B）。
图4 LAMA3 mRNA表达水平与泛癌TMB和MSI的相关性
2.5 LAMA3表达与免疫检查点基因的共表达分析
本研究进一步通过基因共表达分析探讨LAMA3与免疫相关基因之间的关系，结果显示共有47个免疫检查点基因与LAMA3共表达（图5）。LAMA3在泛癌中的表达与OS均有显著的相关性，在HNSC、LUAP、PAAD中LAMA3表达与CD44和CD276均呈正相关。并且在COAD中LAMA3表达与39种免疫检查点基因间有显著的共表达，与其中38种免疫基因呈正相关性；
与肿瘤坏死因子TNFRSF25呈负相关。即LAMA3可能通过调节免疫检查点活性来调控肿瘤免疫应答。
图5 LAMA3 mRNA表达水平与免疫检查点基因共表达的相关性分析
研究结果表明LAMA3在不同组织中广泛表达，在血液和骨髓中几乎不表达，在肺中表达水平最高。考虑到层粘连蛋白的作用，LAMA3在血液和骨髓中几乎不表达属于正常现象。与正常的组织相比，与骨髓相关的癌细胞系LAMA3表达水平上调。结合TCGA和GTEx数据集的泛癌数据进行分析，研究发现LAMA3基因PAAD、COAD等肿瘤中显著高表达，在BRAC、LUAD等肿瘤中显著低表达。预后相关分析显示，在LAML、PAAD中，LAMA3的高表达与患者的预后不良有关。已有研究发现LAMA3在卵巢癌中的表达水平低于正常组织和癌旁组织［4］。另一项研究发现LAMA3在胰腺癌中显著高表达并与不良预后密切相关［6］。除此之外，研究证明LAMA3是口腔癌的早期标志物［7］。这些研究结果与本文分析结果一致。总之，LAMA3可能作为肿瘤早期诊断，或者评估患者预后风险的指标。
肿瘤浸润性淋巴细胞是反映前哨淋巴结状态和患者存活的独立预测因子。研究结果显示LAMA3的表达与多种肿瘤的免疫细胞浸润显著相关，评分最高的是COAD、PRAD、SKCM。肿瘤中免疫细胞的浸润程度能够影响肿瘤的治疗效果，并且在乳腺癌中可用于肿瘤的风险分级［8］。在肿瘤的研究中，TMB和MSI都是有效的预后标志物和免疫治疗反应指标，能够指导COAD患者的临床治疗［9］。本研究发现LAMA3的表达与11种肿瘤的TMB和6种肿瘤的MSI有关。TMB能够通过T细胞引发适应性免疫反应，通过增加新抗原表达来增强肿瘤免疫反应［10］。此外，MSI-H肿瘤中PD-L1的表达水平升高，尤其是在肿瘤浸润免疫细胞上［11］。因此LAMA3基因可能通过影响TMB和MSI进一步调节肿瘤免疫，成为免疫治疗新的靶点和评价免疫治疗效果的重要指标。基因共表达分析结果表明LAMA3可能通过与多种免疫检查点基因相互作用来调节肿瘤免疫。已有研究证实，TNFRSF9激动剂与PD-L1单抗联合使用可以有效地激活和扩增肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞，增强对肿瘤的控制和杀伤，参与各种肿瘤的调控，包括PAAD和LIHC［12］。综上所述，LAMA3可能通过与多种免疫细胞相互作用参与肿瘤的发生发展。
总之，LAMA3在泛癌中的差异表达与肿瘤患者的生存率有关，特别是在PAAD中，并且与TMB、MSI、TIIC和多种免疫相关基因密切相关。因此本研究推测，LAMA3不仅可作为泛癌的预后指标，还能作为免疫治疗反应评估的生物标志物。
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