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周 宁 赵 杰 王丹丹 王秋实 武 艳 代娟娟
1.滨州医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，山东 滨州 256600；
2.滨州医学院附属医院医学研究中心，山东 滨州 256600；
3.大连大学附属中山医院试验动物中心，辽宁 大连 116001
鼻咽癌是一种起源于鼻咽部黏膜上皮的肿瘤。与其他癌症相比，鼻咽癌发病率相对较低。根据国际癌症研究机构的数据，2018年，约有12.9万例鼻咽癌新发病例，仅占2018年确诊的所有癌症的0.7%［1-2］，在全球的地理分布极不平衡，70%的新病例集中在东亚和东南亚。在中国，鼻咽癌患者中男性的发病率是女性的3倍。世界卫生组织将鼻咽癌分为3种亚型：角化性鳞状癌、非角化癌和基底样鳞状癌。诱发鼻咽癌的因素有很多，包括EBV感染、遗传因素和环境因素等。
去甲斑蝥素（norcantharidin， NCTD）是斑蝥素的化学结构中去除1，2位甲基人工合成而得的衍生物［3］。大量体内外研究表明，NCTD不仅对肿瘤细胞的生长有抑制作用，还具有调节免疫功能、上调白细胞、保护肝细胞等功能［4-5］。临床上主要用于食管癌、胃癌及乳腺癌等的治疗，但NCTD对鼻咽癌细胞的作用及机制，文献报道较少。本研究通过不同浓度的NCTD处理细胞，重点研究NCTD对鼻咽癌CNE-2细胞周期及凋亡的影响。
1.1 细胞、主要试剂和仪器
人鼻咽癌 CNE-2细胞购自青旗生物技术发展有限公司-上海细胞库（BFN60800633）。胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）和RPMI 1640培养基均购自美国Gibco公司，NCTD母液购自MCE公司，Trizol试剂和PCR所需引物购于上海生物工程有限公司，逆转录试剂购于Thermo公司，CCK-8试剂购于上海碧云天公司。CO2细胞培养箱（美国Thermo公司），酶标仪（美国Bio-Tek公司），流式细胞仪（美国BD公司）。
1.2 细胞培养
细胞用含10%胎牛血清（FBS）和1%（V/V）青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基于37℃、5% CO2及饱和湿度环境的培养箱中培养。
1.3 测定IC50值
将细胞以5 × 103个/孔接种于96孔板，分别加入不同浓度的NCTD（0、20、40、80、100、200、300、400 μmol/L），每个药物浓度设置3个平行孔，48 h后加入CCK-8 继续培养3 h，采用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度值，通过GraphPad Prism 7.00软件计算NCTD的半数抑制浓度（IC50）值。
1.4 CCK-8实验
将细胞以5 × 103个/孔接种于96孔板，分为对照组和不同浓度NCTD组，分别加入不同浓度的NCTD（0、35、70、140 μmol/L），每个药物浓度设置3个平行孔，每过24 h加入CCK-8继续培养3 h，采用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度值，共测定至72 h，绘制不同药物处理组随时间变化的增殖曲线。
1.5 克隆形成实验
将不同浓度 NCTD［0（对照组）、35、70、140 μmol/L］处理的细胞以1 × 103个/孔的密度接种于6孔板中，每组设2个复孔。14天后，吸尽培养基并用PBS清洗细胞，加入4%多聚甲醛进行固定5 min，再用0.1%结晶紫染液进行染色15 min，用PBS清洗后拍照并计数。
1.6 流式细胞仪检测细胞周期
CNE-2细胞接种于6孔板，培养过夜，不同浓度的NCTD［0（对照组）、35、70、140 μmol/L］处理48 h后，收集细胞，70%预冷乙醇固定过夜，PBS洗2次，PI室温染色30 min后，应该流式细胞仪分析细胞周期。
1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡
CNE-2细胞以5 × 104个/孔的密度接种于6孔板，培养过夜，不同浓度的NCTD［0（对照组）、35、70、140 μmol/L］处理48 h后，收集细胞，应用Vazyme公司的凋亡检测试剂盒进行染色，并通过流式细胞仪分析细胞凋亡情况。
1.8 RT-PCR
收集不同药物浓度处理的细胞，提取细胞的总RNA，应用Themo公司的逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，应用Transgen公司的TransStart Green qPCR SuperMix进行荧光定量PCR，反应条件为95℃，30 s 预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s共40个循环。引物序列Cyclin B 正向为：5"- CATGGTGCACTTTCCTCCTT-3"，Cyclin B反向：5"- AGGTAATGTTGTAGAGTTGGTGT-3"；
GAPDH正向：5"-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAAC A-3"，GAPDH反向：5"-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTG T-3"。并进行3次重复实验，并以GAPDH 作为内参，通过2-ΔΔCt方法计算目的基因的表达量。
1.9 统计学分析
采用SPSS 20.0统计软件。计量资料正态分布以均数 ± 标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。检验水准α= 0.05。
2.1 测定NCTD对CNE-2细胞的IC50值
应用不同浓度的NCTD处理CNE-2细胞，48 h后测定细胞的增殖情况，并计算NCTD对CNE-2细胞的IC50值为（89.07 ± 3.702） μmol/L。见图1。
图1 CCK-8法检测48 h时NCTD对CNE-2细胞的IC50值
2.2 各组细胞的增殖活性
CCK-8实验检测结果显示，药物处理24、48、72 h后，与对照组相比，细胞增殖能力明显减弱，细胞活力值低于对照组，差异具有统计学意义（P＜ 0.01），且随着药物浓度的增加，细胞增殖活性越弱。说明NCTD能够抑制CNE-2细胞的增殖活性，并且具有浓度依赖性。见图2。
图2 CCK8法检测不同浓度的NCTD对CNE-2细胞增殖能力的影响
2.3 各组细胞的细胞克隆数
集落形成实验结果显示，与对照组相比，不同浓度NCTD处理组的细胞克隆数量较对照组降低，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。说明NCTD能够抑制CNE-2细胞的克隆形成能力。见图3。
图3 集落形成实验检测不同浓度的NCTD对CNE-2细胞克隆形成能力的影响
2.4 各组细胞的细胞周期
与对照组相比，NCTD处理细胞后，处于G2-M期的细胞比例较对照组增加，差异具有统计学意义（P＜ 0.01）；
处于G0-G1期的细胞比例较对照组明显减少，差异具有统计学意义（P＜ 0.05），见图4。NCTD处理组中Cyclin B mRNA表达水平低于对照组，差异具有统计学意义（P＜ 0.01），见图5。以上结果表明，NCTD处理后通过抑制Cyclin B的表达使CNE-2细胞阻滞于G2-M期。
图4 流式细胞仪检测各组CNE-2所处细胞周期分布情况
图5 实时定量PCR检测各组CNE-2中Cyclin B的表达水平
2.5 各组细胞的细胞凋亡率
与对照组相比，不同浓度NCTD处理后，细胞的凋亡率增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明NCTD能够促进CNE-2细胞的凋亡。见图6。
图6 流式细胞仪检测不同浓度的NCTD对CNE-2细胞凋亡的影响
鼻咽癌的发病与遗传因素、环境因素和爱博斯坦-巴尔病毒（Epstein Barr virus， EBV）感染密切相关。尽管手术切除及放化疗等手段使鼻咽癌的治愈率有了明显提高，但鼻咽癌早期隐匿，转移早，易复发，5年生存期只有70%左右，晚期转移是导致患者死亡的主要原因［6-7］，同步放化疗是鼻咽癌的主要治疗方法之一［8-9］。化疗与放疗联合治疗虽然取得了令人满意的生存率，但化疗耐药性仍是鼻咽癌复发患者治疗的一大障碍［10］。因此，寻求新的具有临床应用价值的化疗药物对鼻咽癌的治疗具有重要意义。
NCTD是我国最先合成的唯一具有升高白细胞作用的新型抗肿瘤药物。已有研究表明，NCTD在肝细胞癌、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中通过抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞，抗血管生成等发挥抗肿瘤作用［11-14］。NCTD通过抑制Sp1的核转运，干扰Sp1和LncRNA Gm26669启动子区域的结合，减轻肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis, RIF）［15］。还有研究表明，NCTD 通过抑制Fam46c的表达和拮抗ERK1/2信号通路，抑制结直肠癌细胞的增殖和糖酵解［16］。在AML HL60细胞中，NCTD通过抑制Hedgehog/SOX2轴抑制细胞的增殖［17］。NCTD可以通过抑制JAK/STAT3/twist信号通路，进而抑制IL6诱导的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和细胞浸润［18］。但NCTD对鼻咽癌细胞的作用目前尚不清楚，本实验应用不同浓度的NCTD作用CNE-2细胞后，检测对细胞的增殖活性、克隆形成，细胞周期及凋亡的影响。结果发现，NCTD各浓度组细胞的增殖活性、克隆形成能力较对照组明显降低，并存在剂量-效应关系。同时，CNE-2细胞的细胞周期阻滞在G2/M期，并且NCTD各浓度组细胞的凋亡率较对照组细胞明显增加，并存在剂量-效应关系。NCTD有可能是通过抑制Cylin B的表达，抑制细胞增殖并引起细胞周期阻滞，但是NCTD诱导鼻咽癌细胞凋亡的机制尚需进一步研究。综上所述，NCTD可能在鼻咽癌的临床治疗中具有重要作用及应用前景。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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