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张 田， 任 丹
(1.陕西省咸阳市第一人民医院， 陕西 咸阳 7120002.湖北省第三人民医院肿瘤科， 湖北 武汉 430030)
肺癌是人类常见的癌症之一，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要亚型[1]。环状RNA(circRNA)在人NSCLC中存在差异表达，与临床病理特征相关。circRNA BIRC6(circBIRC6)被报道在人NSCLC组织和细胞中上调，促进NSCLC发展[2]。程序性细胞死亡配体1(programmed death receptor ligand 1,PD-L1)是一种重要的免疫检查点分子，在NSCLC中呈高表达，可与程序性细胞死亡受体1(programmed death receptor 1,PD-1)相互作用介导癌细胞逃避免疫监视[3,4]。然而，circRNA BIRC6在NSCLC进展中诱导免疫反应的行为和机制尚未见报道。分化簇44(cluster of differentiation 44,CD44)是癌症干细胞的标志物，在NSCLC中表达上调，与NSCLC的不良预后相关[5,6]。研究显示，CD44为NSCLC中PD-L1表达的关键正调节因子[7]。因此，CD44是抑制NSCLC中PD-L1功能的潜在靶点。circRNA可作为miRNA“海绵”调控下游靶基因表达。据报道，miR-944在恶性肿瘤中发挥抑制或致癌功能。在NSCLC中miR-944下调，上调其表达可抑制NSCLC细胞增殖[8,9]。生物信息学分析发现miR-944为circBIRC6的潜在靶miRNA；
且miR-944包含CD44的结合序列，表明circBIRC6、miR-944和CD44之间可能存在潜在联系。因此，本研究旨在探讨circBIRC6与miR-944以及miR-944与CD44之间的靶点相关性，以阐明这三个分子在NSCLC进展中的调控网络。
1.1材 料
1.1.1细胞：人NSCLC细胞系(H1975、HCC827、H1650、H1299和A549)和人正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0298、CL-0094、CL-0166、CL-0165、CL-0016、CL-0496。A549和BEAS-2B细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，而上述其他细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。
1.1.2主要试剂与仪器：靶向circBIRC6的小分子干扰RNA(siRNA)(si-circBIRC6)、miR-944 mimic、miR-944 inhibitor及其阴性对照(si-NC、miR-NC、inhibitor-NC)由Ribobio(广州，中国)合成。MTT细胞增殖检测试剂盒、膜联蛋白V(Annexin-V)-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京Solarbio公司，M1020、CA1020)；
人可溶性程序性死亡配体-1(sPD-L1)、干扰素-γ(INF-γ)、颗粒酶B、穿孔素ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，ml038111、ml077386、ml060098、ml063483)；
EasySepTM人CD8+T细胞富集试剂盒(加拿大STEMCELL Technologies公司，19053)；
Magna RIP试剂盒(美国Millipore公司，17-700)；
兔源一抗CD44、PD-L1(英国Abcam公司，ab51037、ab205921)。ABI Prism 7500型荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；
iMark680多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司)；
FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)。
1.2方 法
1.2.1qRT-PCR检测circBIRC6、miR-944和CD44 mRNA、PD-L1 mRNA表达：使用TRIzol试剂从细胞中提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA。随后，使用SYBR Green Super Mix试剂盒进行PCR扩增。循环条件：95℃ 5min，然后是 95℃ 10s、60℃ 30s和 72℃ 20s的40个循环。GAPDH是circBIRC6和CD44 mRNA、PD-L1 mRNA的内参，U6是miR-944的内参。通过2-ΔΔCt法计算相对表达的倍数变化。引物序列见表1。
表1 用于RT-qPCR的引物序列
1.2.2Western blot检测CD44、PD-L1蛋白表达：RIPA缓冲液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，取等量总蛋白(30μg)通过10% SDS-PAGE分离并转膜。封闭膜1 h后，在4℃下与一抗孵育1 h：抗CD44(1∶5,000)、PD-L1(1∶1,000)和GAPDH(稀释度，1∶4,000)，然后与二抗(1∶5,000)在室温下孵育1h。使用增强型ECL化学发光试剂使蛋白信号可视化，并使用Image J软件检测蛋白条带的灰度值，目的蛋白与GAPDH灰度值的比值用于统计分析。
1.2.3转染与分组：将A549细胞接种在6孔板中(1×105个细胞/孔)。孵育24h后，将si-circBIRC6、miR-944 inhibitor及其阴性对照si-NC、inhibitor-NC转染到A549细胞中。实验分为正常对照组(NC组，未转染)、si-NC组(转染si-NC)、si-circBIRC6组(转染si-circBIRC6)、si-circBIRC6+anti-NC组(si-circBIRC6与inhibitor-NC共转染)、si-circBIRC6+anti-miR-944组(si-circBIRC6与miR-944 inhibitor共转染)。转染6h，继续培养48h后，收集细胞，qRT-PCR、Western blot检测circBIRC6、miR-944和CD44、PD-L1的mRNA与蛋白表达水平。
1.2.4MTT法检测细胞增殖活性：将转染48h后的各组A549细胞接种在96孔板中，密度为5000个细胞/100μL/孔。培养24、48和72h后，向每孔中加入10μL MTT溶液，继续培养4h后，将100μL/孔的二甲亚砜(DMSO)添加到细胞中溶解甲臜产物。用酶标仪在570nm处读取每孔的光密度(OD)值。
1.2.5Transwell小室检测细胞迁移、侵袭：将A549细胞重悬于无血清培养基中。迁移实验：将200μL(2×104个细胞)细胞悬液置于上室中，下室加入600μL含有10%胎牛血清的培养基。孵育48h后，取出Transwell小室，用湿棉签小心擦除上室底部膜表面细胞，侵入膜下表面的细胞用4%多聚甲醛固定并用0.1%结晶紫染色，然后在倒置显微镜下计数。在侵袭检测中，细胞接种在有Matrigel基质胶的Transwell小室，其余步骤同上。
1.2.6外周血CD8+T细胞的分离培养：使用EasySep人CD8+T细胞富集试剂盒从健康个体的全血中分离CD8+T细胞。在用于进一步实验之前，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养分离的CD8+T细胞。
1.2.7台盼蓝染色测定共培养系统中CD8+T细胞活力：采用微孔2室(Transwell)共培养系统进行共培养。实验分为对照组(Control组，CD8+T细胞单独培养)、NC组、si-NC组、si-circBIRC6组、si-circBIRC6+anti-NC组、si-circBIRC6+anti-miR-944组。除对照组外，其余各组上室接种相应的转染后的A549细胞，下室接种CD8+T细胞(可避免与A549细胞直接接触)。共培养48h后，收集细胞并用0.4%台盼蓝溶液在室温下染色20min，之后，用光学显微镜观察和计数死蓝细胞的数量。活细胞(无细胞质荧光)，死细胞(蓝色细胞质荧光)。使用Image J软件对10个随机视野的台盼蓝阳性细胞进行量化，计算细胞活力(%)[(总细胞-死蓝细胞)/总细胞×100%]。
1.2.8流式细胞术检测共培养系统中CD8+T细胞凋亡：共培养48h后，收集CD8+T细胞并重悬于500μL 1×结合缓冲液中，然后，将细胞在黑暗中用5μL Annexin-V-FITC和5μL PI染色15min。最后，使用FACSCalibur流式细胞仪检测CD8+T细胞凋亡率。
1.2.9ELISA法检测细胞共培养上清液中IFN-γ、IL-4、IL-10水平：共培养48h后，收集细胞培养液，在4℃下以1000×g离心10min取上清液。ELISA法检测上清液中IFN-γ、IL-4、IL-10水平。
1.2.10亚细胞分布分析：提取A549细胞中细胞质和核RNA，然后采用qRT-PCR测定细胞质和细胞核中的circBIRC6水平。GAPDH和U6分别是细胞质和细胞核的内参。
1.2.11双荧光素酶报告(dual luciferase reporter assay,DLRA)基因检测：使用StarBase数据库(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)预测miR-944与circBIRC6和CD44之间的结合位点。将circBIRC6和CD44 mRNA的部分序列(包含与miR-944互补结合位点)克隆到pmirGLO载体中，命名为circBIRC6-WT和CD44-WT。通过定点诱变产生circBIRC6和CD44 mRNA的突变序列，并克隆到pmirGLO载体中以构建circBIRC6-MUT和CD44-MUT。将A549细胞以1×105个细胞/孔的密度接种到24孔板中，将荧光素酶重组质粒与miR-944 mimic或对照(miR-NC)共转染到A549细胞中。转染48 h后，获得细胞裂解物，检测荧光素酶活性。
1.2.12RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)测定：使用Magna RIP试剂盒结合qRT-PCR方法进行RIP测定来验证circBIRC6与miR-944的结合。使用RIP裂解液裂解A549细胞，然后，将含有Argonaute-2抗体(Ago2)或免疫球蛋白G抗体(IgG)的琼脂糖珠与细胞裂解物在4℃下一起孵育6h。IgG抗体为阴性对照。用蛋白酶K缓冲液处理珠子以去除蛋白质。然后，使用TRIzol试剂提取免疫共沉淀的RNA，利用qRT-PCR检测circBIRC6与miR-944的富集。
1.2.13RNA pull-down分析：A549细胞用50 nM的生物素标记的野生型或突变型miR-944(Bio-miR-944-WT或Bio-miR-944-MUT)或阴性对照Bio-miR-NC转染。将细胞培养48 h后，收获并裂解细胞。将M-28链霉亲和素磁珠添加到细胞裂解物中，在4℃下孵育3h以分离生物素偶联的RNA复合物。将珠子在洗涤缓冲液中洗涤，并使用qRT-PCR法纯化和分析结合的RNA。
2.1NSCLC细胞中circBIRC6、miR-944和CD44、PD-L1的表达：与人正常肺上皮BEAS-2B细胞相比，NSCLC细胞(A549、H1975、HCC827、H1650、H1299)中circBIRC6、CD44 mRNA和PD-L1 mRNA的表达升高(P<0.05)，miR-944表达降低(P<0.05)；
其中，A549细胞中circBIRC6、CD44 mRNA和PD-L1 mRNA表达水平均高于其他NSCLC细胞，而miR-944表达较低(P<0.05)。见表2。因此，选择A549细胞用于后续实验。
表2 不同NSCLC细胞系中circBIRC6 miR-944和CD44 PD-L1表达比较
2.2转染后各组细胞中circBIRC6、miR-944和CD44、PD-L1表达比较：与NC组、si-NC组相比，si-circBIRC6组circBIRC6、CD44和PD-L1的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)，miR-944水平升高(P<0.05)；
与si-circBIRC6组、si-circBIRC6+anti-NC组相比，si-circBIRC6+anti-miR-944组CD44和PD-L1的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)，miR-944水平降低(P<0.05)。见图1、表3。
图1 各组细胞中CD44、PD-L1蛋白表达
表3 各组细胞中circBIRC6 miR-944和CD44 PD-L1表达比较
2.3敲低circBIRC6对A549细胞增殖活性的影响：在48和72 h时，与NC组、si-NC组相比，si-circBIRC6组A549细胞增殖活性降低(P<0.05)；
与si-circBIRC6组、si-circBIRC6+anti-NC组相比，si-circBIRC6+anti-miR-944组A549细胞增殖活性升高(P<0.05)。见表4。
表4 各组A549细胞增殖活性比较
2.4敲低circBIRC6对A549细胞迁移、侵袭能力的影响：与NC组、si-NC组相比，si-circBIRC6组A549细胞迁移和侵袭的数量减少(P<0.05)；
与si-circBIRC6组、si-circBIRC6+anti-NC组相比，si-circBIRC6+anti-miR-944组A549细胞迁移和侵袭的数量增加(P<0.05)。见图2、表5。
图2 各组A549细胞的迁移、侵袭能力(×200)
表5 各组A549细胞迁移和侵袭的数量比较
2.5共培养系统中敲低circBIRC6的A549细胞对CD8+T细胞活力的影响：与Control组相比，NC组共培养系统中CD8+T细胞活力降低，CD8+T细胞凋亡率升高(P<0.05)；
与NC组相比，si-circBIRC6组共培养系统中CD8+T细胞活力升高，CD8+T细胞凋亡率降低(P<0.05)；
与si-circBIRC6组、si-circBIRC6+anti-NC组相比，si-circBIRC6+anti-miR-944组共培养系统中CD8+T细胞活力降低，CD8+T细胞凋亡率升高(P<0.05)。见图3、表6。
图3 流式细胞术检测共培养体系中CD8+T细胞凋亡率
表6 共培养系统中敲低circBIRC6的A549细胞对CD8+T细胞活力和凋亡率的影响
2.6共培养系统上清液中sPD-L1、IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和穿孔素水平比较：与Control组相比，NC组共培养系统上清液中sPD-L1水平升高，IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和穿孔素水平降低(P<0.05)；
与NC组相比，si-circBIRC6组sPD-L1水平降低，IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和穿孔素水平升高(P<0.05)；
与si-circBIRC6组、si-circBIRC6+anti-NC组相比，si-circBIRC6+anti-miR-944组sPD-L1水平升高，IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和穿孔素水平降低(P<0.05)。见表7。
表7 共培养系统上清液中sPD-L1 IFN-γ TNF-α 颗粒酶B和穿孔素水平比较
2.7circBIRC6在A549细胞中充当miR-944海绵:亚细胞定位分析结果显示，在A549细胞的细胞质中，circBIRC6的比例较高，而在细胞核中circBIRC6的比例较低(图4A)。通过StarBase数据库预测，miR-944被确定为circBIRC6的潜在靶标(图4B)。DLRA检测结果显示，与转染miR-NC相比，转染miR-944 mimic后，含有circBIRC6-WT质粒细胞的荧光素酶活性降低(P<0.05)，而含有circBIRC6-MUT质粒细胞的荧光素酶活性无显著变化(P>0.05，图4C)。RIP检测结果显示，相对于IgG对照组，circBIRC6和miR-944在Ago2复合物中高度富集(图4D)。生物素标记的RNA pull-down结果显示，circBIRC6被Bio-miR-944-WT拉下，而不是Bio-miR-944-MUT(图4E)。
图4 circBIRC6靶向调节miR-944表达A：qRT-PCR显示circBIRC6在A549细胞的细胞质和细胞核中的分布；
B：生物信息学数据库中预测的circBIRC6和miR-944的靶向结合序列；
C：用于验证circBIRC6和miR-944之间关系的DLRA测定结果；
D：RIP实验证实circBIRC6和miR-944可以被Ago2抗体沉淀；
E：使用qRT-PCR在由生物素化miR-944探针拉下的样品中检测circBIRC6富集；
*P<0.05
2.8CD44为miR-944的靶标:使用StarBase数据库预测miR-944的靶基因，发现CD44的3"UTR具有与miR-944互补的序列(图5A)。DLRA结果显示，与miR-NC相比，转染miR-944 mimic后，含CD44-WT质粒细胞的荧光素酶活性降低(P<0.05)，含CD44-MUT质粒细胞的荧光素酶活性未受显著影响(P>0.05，图5B)。
图5 CD44是miR-944的靶标A：生物信息学数据库中预测的miR-944和CD44的靶向结合序列；
B：用于验证miR-944和CD44之间关系的DLRA测定结果；
与miR-NC相比，*P<0.05
以往的研究表明circBIRC6[2]、CD44[5,6]和PD-L1[4]作为癌基因，而miR-944作为抑癌基因在NSCLC发展过程中发挥作用[8,9]。本研究结果显示，circBIRC6在NSCLC细胞中的表达明显升高，功能实验证实，敲低circBIRC6可抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭，与以往的研究结果一致；
表明circBIRC6可作为一种致癌基因，在NSCLC的恶性进展中发挥关键作用。然而，circBIRC6是否在NSCLC的免疫逃逸中发挥作用仍有待探索。
先前的研究表明，miR-944在肺癌[10]的发生和进展中起着至关重要的作用。本研究结果显示，circBIRC6和miR-944在NSCLC细胞中呈“一高一低”的表达趋势，这与既往的发现一致。亚细胞定位分析结果显示circBIRC6主要存在于细胞质中，可能作为特定miRNA的分子海绵调控NSCLC的发生。本研究通过生物信息学预测发现miR-944与circBIRC6具有互补的结合位点。在A549细胞中敲低circBIRC6后，miR-944的表达增加。随后，双荧光素酶报告分析验证了miR-944是circBIRC6的潜在靶基因；
RIP和RNA pull-down检测结果进一步证实circBIRC6和miR-944可以在A549细胞中结合；
表明circBIRC6可以靶向并结合A549细胞中的miR-944，二者呈负调控。Liu等[8]人的体外实验显示，miR-944的过表达抑制了NSCLC细胞的增殖。这些结果表明，circBIRC6可能通过与miR-944竞争性结合来促进NSCLC的发展。
miR-944可与多种靶基因的3"-UTR相互作用。在这些靶基因中，与肿瘤免疫逃逸最相关的一个是CD44。据报道，CD44在NSCLC中表达上调，与NSCLC的不良预后相关[5,6]，并且CD44与肺癌中的PD-L1表达和免疫细胞浸润呈正相关，是NSCLC中抑制PD-L1功能的潜在靶点[7,11]。一致的，在本研究中CD44和PD-L1在NSCLC细胞中表达升高，与miR-944表达趋势相反。StarBase数据库预测到miR-944和CD44之间存在靶位点，表明CD44是miR-944的潜在靶标。双荧光素酶报告实验进一步证实CD44是miR-944的靶基因。此外，circBIRC6的敲低降低了CD44 mRNA和蛋白表达水平，PD-L1的mRNA和蛋白水平也随之降低，而miR-944的下调能够逆转circBIRC6的敲低对CD44 mRNA和蛋白表达水平的影响，提高了NSCLC细胞的增殖活力，增强了NSCLC细胞的侵袭和迁移能力。这些结果表明circBIRC6通过充当miR-944的海绵上调癌基因CD44表达。
PD-L1在多种肿瘤中过表达，包括NSCLC[12]。PD-L1在正常组织中的存在有助于宿主免疫的稳态，而在癌症中，T细胞上的PD-1和肿瘤细胞上的PD-L1之间的相互作用，抑制抗原特异性CD8+T细胞的活化、扩增和效应功能，并帮助癌细胞逃避免疫破坏[13]。sPD-L1是一种通过ELISA测量的血液中可溶形式的PD-L1[14]。为了阐明circBIRC6在NSCLC免疫逃逸中的作用与机制，本研究通过将A549细胞与CD8+T共培养在Transwell共培养系统中，以避免直接的细胞间接触。结果显示，A549细胞分泌sPD-L1在共培养系统中诱导CD8+T细胞死亡，还降低了共培养系统上清液中IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和穿孔素的水平，表明NSCLC细胞通过在体外共培养系统中分泌sPD-L1来灭活CD8+T细胞。而circBIRC6敲低的A549细胞减少了PD-L1的分泌，激活了共培养系统中的CD8+T，抑制了CD8+T细胞凋亡，且上调了共培养系统上清液中IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和穿孔素的水平。相反，在敲低circBIRC6的A549细胞中下调miR-944会使共培养系统中的CD8+T细胞失活；
表明circBIRC6的敲低可下调PD-L1分泌，促进CD8+T细胞活化并分泌细胞因子，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。
综上，敲低circBIRC6可通过下调PD-L1的表达和分泌，激活肿瘤微环境中的CD8+T细胞，抑制NSCLC的免疫逃逸；
其介导NSCLC免疫逃逸的机制可能与miR-944/CD44轴对PD-L1的调控作用有关。本研究表明circBIRC6是治疗NSCLC的潜在靶点，并为circBIRC6提供了新的调控机制。然而，circBIRC6、miR-944和CD44在NSCLC患者中的表达水平及相关性尚需进一步的验证；
此外，尚需体内实验进一步验证circBIRC6介导NSCLC免疫逃逸的分子机制，在未来的研究中将进行补充。
