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常业飞 郑盛 胡滔 洪颖 钟勇 张晓珺
作者单位：650011 云南省第三人民医院检验科
肝细胞癌 (HCC) 是全球第六大常见癌症，也是全球癌症相关死亡的第三大原因[1]。预计世界上最常见的 HCC 潜在病因将是代谢相关性脂肪肝，超过酒精和病毒性肝硬化[2]。脂质代谢的改变已被认为是癌症的标志之一，因为不受限制的脂肪生成为癌细胞提供了足够养分，使其不受控制地增殖[3]。最近的证据表明，癌细胞的代谢变化会增加小鼠肥胖模型的致癌作用[4]。最近的一项研究表明，甾醇调节元件结合蛋白 1c (SREBP1c)是脂肪生成基因转录的主要调节因子，有助于HCC进展[5]。与此一致，HCC 细胞中 SREBP1c 的抑制引起肝细胞癌停滞和细胞凋亡，而SREBP1c的过表达会增加细胞增殖[6]。尽管脂质代谢改变在肝癌发生背后的分子机制仍不清楚，但这些发现表明，脂肪生成增加是HCC进展的驱动力。富含半胱氨酸型酸性蛋白(SPARC)是一种参与不同生物过程的蛋白质，包括组织更新、对损伤的伤口愈合反应、组织重塑和纤维化[7]。此外，在病态肥胖NAFLD患者和饮食诱导NAFLD小鼠的样本中，SPARC肝脏表达增加与更明显的肝损伤和纤维化相关[8]。然而, SPARC 在代谢相关性脂肪肝相关肝癌发展中的作用仍未阐明。本研究进一步探讨SPARC表达对代谢相关性脂肪肝相关肝癌的影响及其作用机制，旨在为进一步研究提供一定依据。
一、样本来源
SPF级、雄性大鼠34只，8月龄，体质量400～450 g，购于上海杰思捷实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2020-0004。
二、主要试剂
链脲佐菌素，购自中国上海如吉生物科技公司；
TRIzol 试剂，购自赛默飞世尔科技；
天狼星红/天狼猩红染色液试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；
油红O染色试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；
DyNAmo HS SYBR Green qPCR试剂盒购自赛默飞世尔科技；
鼠抗 SREBP1等单克隆抗体，购自艾美捷科技有限公司；
等。
三、主要仪器
血细胞计数器(上海上碧实验仪器有限公司)；
Couvter型高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；
DM 750型光学显微镜(日本Olympus公司)；
Spectra Max M5型多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；
定量PCR仪器(赛默飞世尔科技)；
分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；
RM2235型石蜡切片机(德国Leica公司)等。
四、方法
(一) 大鼠实验 体内实验利用雄性SPF级大鼠和SPARC基因敲除大鼠生成 STAMTM 小鼠模型，以研究NASH背景下的HCC发展。注射皮下剂量 (200 μg) 链脲佐菌素。并连续4周进行高脂肪饮食喂养，16周后安乐死，并评估肿瘤大小。高脂肪饮食成分：酪蛋白酸钙 (200 g/kg)、维生素混合物 (10 g/kg)、纤维素 (50 g/kg)、动物脂肪 (250 g/kg)、维生素 A (1 mL/kg)、酒石酸氢胆碱 (2.5 g/kg)、麦芽糖糊精 (451.5 g/kg)。本研究经我院动物研究委员会审查和批准。
(二)体外实验方案 通过胶原酶灌注从对照组和研究组大鼠中分离肝细胞。肝细胞在不含酚红的10% 胎牛血清中培养(每组17份)。培养2 d后将细胞与不同浓度1 mM的游离脂肪酸 (FFA)、2:1油酸和棕榈酸的混合物孵育过夜，16 h后进行实验。
(三)病理分析 肝肿瘤和非肿瘤组织固定在10%甲醛溶液中并包埋在石蜡中。确定肝实质内的肿瘤区域。对于肝纤维化评估，肝脏切片用天狼星红染色，并按照 Camino 等的描述对胶原纤维进行定量。新鲜肝组织在最佳切割温度化合物中冷冻，并用油红O及苏木精伊红染色进行脂质分析。
(四)细胞染色 原代肝细胞培养物使用油红O染色用于脂质分析。使用100%异丙醇提取染料，并使用分光光度计在510 nm处测量吸光度以量化细胞内脂质含量。
(五)蛋白质印迹分析 大鼠肝脏组织用1 mL组织裂解缓冲液裂解，在冰浴中在玻璃研磨机中研磨成匀浆，然后4 ℃裂解30 min，离心20 min。将十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，5%牛血清白蛋白封闭1 h，用PBS洗涤5 min。随后，将膜与以下一抗一起孵育：鼠抗SREBP1在4 ℃下过夜。然后用PBS冲洗膜5次(每次5 min)，然后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG在室温下孵育1 h。接下来，将膜浸入增强型化学发光溶液。在无光条件下显影后，观察条带并拍照。
(六)逆转录定量聚合酶链反应 将细胞培养物或鼠肝脏肿瘤和非肿瘤组织均质化，并使用TRIzol试剂提取总RNA。使用500 ng Oligo (dT) 引物，用200 U SuperScript II逆转录酶逆转录 RNA(2 μg)。对cDNA进行qPCR。PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LXRα、CPT1、LIPIN、ACADSB 和 ACOX1 mRNA 水平通过SYBR Green qPCR进行量化。使用相对定量方法(2-ΔΔCt)计算SPARC、PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LxRα、CPT1、Lipin、ACADSB和ACOX1相对于GAPDH的mRNA表达。
(七)代谢标记和脂质分析 细胞培养完成后收获前将细胞与2 μCi/mL [U-14C]-甘油孵育1、2 和 3 h。计数后，细胞在无菌PBS中洗涤并进行脂质提取。通过薄层色谱法(TLC)分离脂质种类。通过与相应的标准品和保留因子进行比较来鉴定不同的脂质种类。掺入甘油磷脂 (GPL) 和脂肪酸和中性甘油脂 (GL-TAG) 的放射性通过放射自显影进行可视化，并通过闪烁计数进行量化。
(八)甘油三酯定量测定 将大约0.1 g的肝组织样品与1 mL氯仿/甲醇 (2:1) 溶液均质化。低速离心后转移到另一管中并在氮气流下干燥，样品溶解在100 μL异丙醇中，使用酶联免疫吸附试验测量异丙醇中的胆固醇和甘油三酯水平。
(九)细胞细胞凋亡评估 将分离的原代肝细胞 (3×103) 接种到96孔板上，并使用1 mM的游离脂肪酸处理，通过吖啶橙-溴化乙锭混合物染色评估与细胞凋亡相关的形态学变化。从四个独立的实验中计数至少100个细胞，并确定活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百分比。
五、统计学方法
一、SPARC的缺失会增加脂肪变性并引起大鼠代谢相关性脂肪肝相关肝癌发生
在第16周时，两组所有大鼠均发展为肝癌，且研究组肝癌平均直径(1.39±0.14)mm显著高于对照组(1.01±0.09)mm；
NAS评分显示，研究组大鼠脂肪变性评分(2.71±0.25)分显著高于对照组(1.55±0.19)分，研究组小叶炎症评分(0.74±0.09)分显著低于对照组(1.27±0.11)分。HE染色结果显示，研究组大鼠门静脉炎症减弱(见图1)；
天狼星红染色结果显示，研究组大鼠肝脏纤维化病变高于对照组(见图2)。
注：左至右分别为对照组、研究组
注：左至右分别为对照组、研究组
二、SPARC敲除引起肝细胞脂质含量增加
体外研究中，油红O染色结果显示，研究组细胞脂质沉积增加，且GL-TAG、GPL表达显著高于对照组(见表1、图3)。
表1 两组油红O染色及GL-TAG、GPL表达比较
注：左至右分别为对照组、研究组
三、SPARC敲除引起肝细胞甘油三酯合成增加
体外实验显示，研究组肝细胞中[U-14C]-甘油表达显著高于对照组(见表2)。
表2 两组细胞不同时间[U-14C]-甘油表达比较(pomL/106)
四、SPARC敲除通过上调脂肪生成酶刺激肝脏脂质代谢
体外实验发现，研究组PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LXRα、CPT1、LIPIN、ACOX1 mRNA表达显著低于对照组(P<0.05)，两组ACADSB mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
五、SPARC敲除增强肝细胞增殖活性
吖啶橙-溴化乙锭染色结果显示，研究组细胞活力高于对照组，细胞存活率(97.89±1.44)%显著高于对照组(48.47±1.21)%。见图4。
注：左至右分别为对照组、研究组
表3 两组PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LxRα、CPT1、Lipin、ACOX1 mRNA表达比较(2-ΔΔCt)
六、SPARC敲除诱导SREBP1c核易位
免疫荧光检测结果显示，研究组细胞增加肝细胞中SREBP核定位，蛋白印迹实验结果显示，研究组AMPK、α-Tubulin蛋白表达低于对照组(见图5、图6)。
注：左至右分别为对照组、研究组
注：左至右分别为对照组、研究组
在这项工作中，我们证实了SPARC的缺失会增加肝细胞中的脂质沉积，并且SPARC在调节肝脏脂质代谢方面具有关键作用[9]。研究组肝细胞显示出脂滴含量增加和脂质转运蛋白基因(CD36、FABP4、FABP5)、脂肪生成基因(FASN、ACC1、SREBP1)和参与β-氧化和TG合成的基因 (LIPIN1)的更高表达。此外，在研究组肝细胞中观察到TG合成增加。我们进一步研究了脂质超载对肝细胞的影响，并观察到与对照组小鼠相比，研究组肝细胞在游离脂肪酸中显示出更高的细胞活力、增殖和抗凋亡能力。最后，我们证实了在 NAFLD-HCC模型中敲除SPARC会加速 HCC的发展。RNA-seq研究表明，在研究组大鼠中，与脂质代谢、细胞解毒和增殖相关的通路上调。SPARC在多种组织中表达，发挥多种重塑和代谢功能[10]。在脂肪组织中，SPARC 抑制脂肪生成可能是因为刺激Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制脂肪生成转录因子，包括CAAT/增强子-结合蛋白α (C/EBPα)、CAAT/增强子结合蛋白β (C/EBPβ) 和过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)。在骨骼肌中，SPARC 充当代谢增强剂和运动介质，另一方面，研究组小鼠随着年龄的增长和高脂肪饮食条件出现严重的葡萄糖稳态改变[11-12]。因此，观察到的脂质沉积增加可能与脂肪生成增加及葡萄糖稳态改变相关。
有研究指出，SREBP1介导的脂肪生成途径和SREBP1c的高表达与肝癌的不良预后相关[13]。此外，抑制SREBP1c核易位可抑制DEN诱导的HCC生长。本研究中观察到 SPARC 的缺失或抑制会增加 SREBP 定位在肝细胞核中， SPARC 可能与 AMPK 相互作用，SPARC 对 SREBP 细胞定位的影响可能是通过调节AMPK活性来介导的。本研究中，研究组大鼠SPARC敲除后，AMPK激活明显减少。周源[14]证实SPARC是一种AMPK相互作用蛋白，可能通过AMPK激活参与调节代谢。因此，笔者推测SPARC可能直接或间接与AMPK相互作用，阻止其活化从而调节脂质代谢。
脂肪生成是增强癌症最重要的代谢标志之一[15]。脂肪酸促进了与癌细胞发育、进展和存活相关的重要过程[16]。脂肪生成的变化在致癌过程的早期开始，并随着肿瘤细胞变得更具侵略性而进一步扩大。脂质代谢失调和肝脏中TG 的积累是代谢相关性脂肪肝的关键基础，代谢相关性脂肪肝是一种会增加肝癌发展风险的疾病。脂质代谢重编程被认为是非酒精性脂肪性肝炎相关肝癌中的一个重要基础[17]。因此，需要确定代谢相关性脂肪肝背景下参与肝癌发生的新途径。为了进一步研究非酒精性脂肪肝环境中SPARC介导的代谢改变，我们在研究组小鼠中使用了非酒精性脂肪肝-肝癌模型。结果显示，与对照组相比，SPARC敲除导致肝脏脂质沉积加速，脂肪变性增加及纤维化。然后，我们在 16 周后评估了大鼠肝癌的发展，并观察到研究组大鼠显示出肝癌加速生长。Atorrasagasti等[18]报道在裸鼠皮下接种时，SPARC在HCC 细胞中的过表达导致其致瘤性降低，部分是通过诱导间充质到上皮的转化。此外，本研究发现，研究组大鼠肝癌进程加快，并且与肝脏炎症和纤维化程度降低有关。考虑到患有脂肪变性的肥胖患者HCC发病率正在稳步增加，我们的研究结果可能具有重要意义。但本研究仍有不足，如本研究中大鼠虽在短时间内发展为HCC，但与人非酒精性脂肪性肝炎进展为肝癌的缓慢病程具有差异，且多数肥胖患者伴有胰岛素抵抗和2型糖尿病，本研究并未对此进行造模对比。此外，链脲佐菌素可能对肝细胞具有独立的致癌作用，因为据报道它是一种破坏DNA的烷化剂。但本研究所获取结果仍具有较高参考价值，对进一步阐明SPARC与关键脂质代谢蛋白相互作用机制的研究具有参考意义。
综上所述，SPARC敲除可通过调节大鼠脂质代谢、细胞活力及肝细胞内脂质积累增加等途径影响代谢相关性脂肪肝相关肝癌发展。
利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。
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