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谭莲英，夏忠悦，钱成林，董成虎，宋艳梅，范光彩
1 新希望乳业股份有限公司，四川成都 610011
2 乳品营养与功能四川省重点实验室，四川成都 611730
3 夏忠悦劳模和工匠人才创新工作室，四川成都 611730
在世界上已知的各种食物里，牛奶是大自然赐予人类最接近完美的食物，被誉为“白色血液”。牛奶中存在的蛋白质主要有酪蛋白和乳清蛋白两大类，酪蛋白主要分αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白；
乳清蛋白主要分为β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白及其他微量蛋白[1]。奶牛存在不同酪蛋白遗传变异体，根据牛奶中酪蛋白的特定氨基酸位置来确定每一种亚型，不同酪蛋白在消化过程中会产生不同的生物活性产物，对人体具有不同的生理功能。本文研究了不同酪蛋白亚型的比例及其功效、基因分型鉴定方法和实际应用，以区分不同牧场牛群的遗传变异体类型和比例，指导牧场快速分群饲养奶牛，分别生产不同类型的生乳，加工高品质乳制品。
牛奶酪蛋白主要分αs酪蛋白（包含αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白）、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，四者的比例约为40∶10∶35∶12，该比例会影响酪蛋白胶束的稳定性。
αs1-酪蛋白是牛奶中最常见的酪蛋白形式，已被报道具有抗氧化和自由基清除作用，还与酪蛋白从内质网向高尔基体的转运有关。
αs2-酪蛋白的蛋白水解片段已被证明具有抗菌活性。特别是39氨基酸杀细胞粒体-1（Casocidin-1）肽段已被证明能够抑制大肠杆菌（E. coli）和葡萄球菌（Staph.carnosis）的生长。
在牛奶凝结过程中，κ-酪蛋白被凝乳酶水解可释放水溶性片段，副κ-酪蛋白和疏水性酪蛋白巨肽。其中的酪新素A、B和C具有阿片拮抗活性，酪新素C可结合补体C3a受体[1]。
1.1 牛奶中β-酪蛋白遗传变异体基因分型及其功效
β-酪蛋白及其片段已被证明具有多种功效，已被报道能够激活巨噬细胞的吞噬作用和过氧化物释放。β-酪蛋白也是一种酪啡肽来源，酪啡肽可能是二肽基肽酶IV的水解产物，具有阿片样活性，可结合阿片受体[2]。
β-酪蛋白在酪蛋白中含量第二，占总酪蛋白的35%。因为编码这些蛋白的基因在不同的牛里面是不一样的，所以β-酪蛋白有7 种不同的形式，最常见的两种是A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。只含有A2 β-酪蛋白而不含有A1β-酪蛋白的牛奶为A2牛奶。含纯A2β-酪蛋白的A2牛奶可帮助改善人类摄入某些乳制品后的消化道不适症状。一项随机、双盲、交叉试验中，45 名自述有乳糖不耐受症状的受试者分别摄入仅含A2β-酪蛋白和含有A1、A2两种类型β-酪蛋白的牛奶，经过14 天治疗期及14 天基线期和治疗期之间的洗脱期，再通过胶囊内镜检测胃肠功能、进行精细认知障碍测试（SCIT）等，结果显示，与仅含A2 β-酪蛋白的牛奶相比，摄入同时含2 种类型β-酪蛋白的牛奶可以导致炎症相关生化指标和β酪啡肽水平升高、胃肠道通过时间延长、短链脂肪酸水平降低、SCIT反应时间延长及错误率增加[3]。相反，摄入仅含A2β-酪蛋白牛奶者症状则未加重。通过动物试验比较了A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白对肠胃产生的作用。与含A2β-酪蛋白的牛奶相比，给啮齿类动物喂饲含A1β-酪蛋白的牛奶可明显延迟胃肠传输时间[4]，使消化道产生不适症状。此外，给小鼠的无奶基础饮食中添加A1β-酪蛋白后，小鼠肠道炎症标志物明显增多，而添加A2β-酪蛋白的基础饮食对小鼠则未产生作用[5]。
1.2 牛奶中κ-酪蛋白遗传变异体基因分型及其功效
κ-酪蛋白是牛乳中酪蛋白的组成之一，在牛脱脂乳中约占总酪蛋白的13%。κ-酪蛋白是使牛奶保持稳定的乳浊液态的重要因子，不仅在酪蛋白微团的稳定性方面起到至关重要的作用，且对奶牛泌乳性能及乳成分组成和奶酪品质均有一定程度的影响[6]。
与αs-酪蛋白和β-酪蛋白不同，κ-酪蛋白在N-和C-末端有两个带电区段，这一结构差别决定其功能特点。
κ-酪蛋白具有A、B两种不同的变异体（A型和B型），κ-酪蛋白中κ-CN A和κ-CN B的结构差异是第148位和136位氨基酸类型不一致。κ-CN A第148位为Asp（天冬氨酸），第136位为Thr（苏氨酸），κ-CN B第148位为Ala（丙氨酸），第136位为Ile（异亮氨酸）。
用携带κ-酪蛋白B型基因的奶牛产的牛乳比κ-酪蛋白A型生产的奶酪产量更高、凝乳更快、硬度更适中[6]。
κ-酪蛋白的水解产物具有抗凝血酶原肽、免疫刺激肽、酪蛋白阿片肽等物质，均具有生理活性功能[6]。
由于不同β-酪蛋白、κ-酪蛋白遗传变异体基因构型牛奶有不同的生理活性，且目前的鉴定方法较复杂，有必要研究简单易行可推广应用的鉴定方法。
2.1 基因鉴定
目前常用的基因鉴定方法有：等位基因特异PCR法（AS-PCR）、创造酶切位点PCR法（ACRSPCR）、单链构象多态性PCR法（SSCP-PCR）、Taq Man等方法，可通过奶牛族谱、基因DNA测序等基因检测技术来鉴定不同酪蛋白遗传变异体奶牛基因。
通过基因鉴定筛选区分携带不同遗传变异体基因型β-酪蛋白和κ-酪蛋白奶牛，准确度能达到99%以上，适宜直接鉴定奶牛基因型，但基因鉴定无法直接鉴定乳及其制品的蛋白质类型。
2.2 毛细管电泳仪分离检测
毛细管电泳仪和SDS-MW Protein Analysis kit分离检测乳及其制品中乳清蛋白及酪蛋白类型，利用动态涂层毛细管将乳清蛋白和不同遗传变异体构型的蛋白质分离，紫外或二极管阵列检测器检测A1-β酪蛋白、A2-β酪蛋白。确定牛奶是否为某一纯的β-酪蛋白或是混合型[7，8]。
2.3 高效液相色谱仪分离检测
高效液相色谱法分离检测乳及其制品中酪蛋白类型，利用反相高效液相色谱梯度洗脱，根据不同遗传变异体酪蛋白保留时间和峰面积确定样品中酪蛋白的类型和含量。
2.3.1 试验过程
常用设备：高效液相色谱仪（带自动进样器，UV或二极管阵列检测器）、离心机（离心力大于1 0000 r/min）、色谱柱（型号：ZORBAX 300ABond 300SBC8；
规格：250 mm×4.6 mm，3.5 μm）、涡旋仪等。
主要试剂：TFA、盐酸胍、双（2-羟乙基）氨基-三（羟甲基）甲烷和、磷酸氢二钠、β-巯基乙醇、乙腈。
检测条件：波长：214 nm；
流动相A：0.1% TFA水溶液；
流动相B：0.1% TFA乙腈溶液；
进样量：50 μL；
色谱柱温度：40 ℃。
表1 梯度洗脱程序
生乳或乳制品样品预冷至2～4 ℃，再经10 000 r/min离心力冷冻离心大于10 min，弃去上面脂肪层；
取中间清液1 mL于10 mL离心管中，加入5 mL缓冲溶液（5 mol/L盐酸胍、0.08 mol/L双（2-羟乙基）氨基-三（羟甲基）甲烷、5 mmol/L磷酸氢二钠的混合水溶液），混匀，室温下静置反应2 h；
将样品涡旋混匀，在 1 2000 r/min离心力作用下离心10 min；
取下层液体1 mL，加入990μL 5 mol/L盐酸胍水溶液，10 μL 10%β-巯基乙醇水溶液，混匀，离心，将离心后液体用0.22 μm水系微孔滤膜过滤于样品瓶中，待测样品用于高效液相色谱仪检测。标准品用相同的方式处理后上机测定（图1）。
图1 高效液相色谱仪分离A1、A2β-酪蛋白图谱
2.3.2 试验结果与分析
标准品在0.2～3 mg/mL浓度范围内，A2-β-酪蛋白浓度与峰面积呈正相关，线性回归方程为y=4.14e-5x-0.00024，其中y为A2-β-酪蛋白浓度，x为峰面积；
线性相关系数为r=0.9956，符合GB/T 27417—2017中对于准确定量方法，线性回归方程的相关系数不低于0.99的要求[9]。
选取不同生乳、灭菌乳、巴氏杀菌乳样品前处理后，平行测定6 次，得到生乳相对标准偏差为0.81%～2.40%，巴氏杀菌乳相对标准偏差为0.78%～1.33%，灭菌乳相对标准偏差为0.19%～1.09%（表2），符合GB/T 27417—2017中当被测组分含量在1%时，试验室内变异系数小于2.7%的要求[9]。
表2 方法精密度试验结果
分别选取生乳、巴氏杀菌乳和灭菌乳基质添加不同浓度的A2-β-酪蛋白进行三水平六平行加标回收试验。生乳分别添加2.60 mg/mL、5.44 mg/mL、10.80 mg/mL，每个浓度分别测定6 次，得到回收率范围为92.5%～105.2%；
灭菌乳分别添加2.40 mg/mL、4.80 mg/mL、9.60 mg/mL三个浓度水平，分别测定6 次，得到回收率范围为94.2%～104.0%；
巴氏杀菌乳分别添加2.40 mg/mL、4.80 mg/mL、9.60 mg/mL，每个浓度分别测定6 次，得到回收率范围为94.6%～102.8%（表3）。
表3 不同基质加标回收率
采用高效液相色谱法分离检测100 份不同牧场单个牛体生乳样本，通过试验分离发现不同牛体所含有的酪蛋白类型不同，其中部分牛体只含有单一的κ-酪蛋白、β-酪蛋白，混合型牛体占比较高，其中混合型κ-酪蛋白（同时含κ-CN A和κ-CN B）占比为50%～60%，混合型β-酪蛋白（同时含β-CN A1和β-CN A2）占比为60%～70%（图2）。
图2 不同牛乳样本中酪蛋白类型占比
不同β-酪蛋白、κ-酪蛋白变异体基因构型牛奶有不同的生理活性功能，有必要对其进行分型鉴定。
β-酪蛋白、κ-酪蛋白遗传变异体基因亚型牛奶的鉴定方法多样，本文对比了不同的鉴定方法，重点通过试验对高效液相色谱分离鉴定方法进行验证，方法精密度和回收率均满足要求，且能有效分离不同κ-酪蛋白和β-酪蛋白。通过对牧场不同牛乳样本进行分型鉴定发现，同时具有κ-酪蛋白A型和B型基因型的牛乳占比在50%以上，单一κ-酪蛋白A型牛乳、κ-酪蛋白B型牛乳占比分别在30%～40%、10%～15%。其中A2β-酪蛋白牛奶占比为25%～35%。研究发现高效液相色谱分离鉴定方法既可用于奶牛的分型鉴定，又可用于生牛乳及其生产的乳制品的酪蛋白类型鉴定，可以帮助生产企业开发不同类型的乳制品。
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