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陈小波 豆倩影 黄立新
南阳市中心医院整形外科，河南473000
微小RNA⁃203（miR⁃203）作为一种抑癌基因在恶性黑素瘤中低表达，可调控黑素瘤细胞增殖、迁移过程［1］。锌指蛋白281（zinc finger protein 281，ZNF281）是锌指蛋白的一种亚型，在恶性肿瘤或癌变细胞中高表达，有诱发肿瘤的作用［2］。研究［3］表明，miR⁃203 可抑制锌指蛋白217 在结直肠癌中的表达，降低其致癌性。miR⁃203是否可调节黑素瘤中ZNF281蛋白水平，从而影响黑素瘤细胞的增殖及迁移目前尚未见报道。本研究以黑素瘤细胞系A375、M14为研究对象，探讨miR⁃203对A375、M14细胞增殖、迁移的影响，并初步探讨其机制，为临床应用提供一定参考。
一、材料与方法
1.细胞系及主要试剂：人血管内皮细胞系ECV304、人黑素瘤细胞系M14（上海宾穗生物科技有限公司，批号分别为BSC⁃5107481307⁃01、BSC⁃504847958⁃01）；
人黑素瘤细胞系A375、SK⁃MEL⁃28、SK⁃MEL⁃2（上海名劲生物科技有限公司，批号分别为CM⁃1030、CM⁃1813、CM⁃1811）。
miRNA 提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA 第1 链合成试剂盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）［天根生化科技（北京）有限公司，批号分别为DP501、FP401、FP205⁃02］；
LipofectamineTM2000 转染试剂盒、miR⁃203 模拟物、miR⁃203模拟物阴性对照、miR⁃203抑制剂、miR⁃203抑制剂阴性对照（广州锐博生物科技有限公司，批号分别为P0309、P0716、P0703、P5047、P3066）；
CCK8 试剂盒（碧云天生物科技有限公司，批号C0037）；
草酸铵结晶紫染色液（上海博谷生物科技有限公司，批号PT007）；
双荧光素酶报告基因检测试剂盒、一抗ZNF281（抗兔）、内参GAPDH（抗兔）、二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体（美国Abcam公司，批号分别为ab228530、ab101318、ab181602、ab205718）。
2.细胞培养：各培养基添加胎牛血清制成含10%胎牛血清培养基4 ℃备用。ECV304、SK⁃MEL⁃28 细胞用RPMI1640 培养基培养，A375、M14 细胞用DMEM 培养基培养，SK⁃MEL⁃2 细胞用MEM 培养基培养，均置于CO2培养箱中37 ℃常规培养，待细胞密度达85%时扩大培养。收集各组细胞检测miR⁃203 水平，采用与ECV304 差异较大的A375、M14细胞系进行下一步研究。
3.实验分组及处理：生长良好的A375、M14细胞稀释成2×104个/ml，分别接种于24孔板中，每孔500 μl，待细胞密度达50%时转染。按照LipofectamineTM2000 转染试剂盒说明书操作，实验分5组：对照组（细胞正常培养）、miR⁃203模拟物对照组（加入50 nmoL/L miR⁃203 模拟物阴性对照）、miR⁃203 抑制剂对照组（加入50 nmoL/L miR⁃203 抑制剂阴性对照）、miR⁃203 模拟物组（加50 nmoL/L miR⁃203 模拟物）、miR⁃203抑制剂组（加50 nmoL/L miR⁃203抑制剂）。各组细胞置于37 ℃培养箱中培养24 h。
4.实时荧光定量PCR 检测miR⁃203 表达水平：收集细胞，miRNA 提取分离试剂盒提取总RNA（200 ng），用miRcute miRNA cDNA第1链合成试剂盒合成cDNA，PCR仪扩增miR⁃203、内参U6。miR⁃203 正向引物序列：5′⁃TGCTC TGAGGCGTCTAAGGCGTCCG⁃3′，反向引物序列：5′⁃CCCAA GCTTCACCTCCCAGCAGCACTTG⁃3′；
内参U6 正向引物序列：5′⁃CTCGCTTCGGCAGCACA⁃3′，反向引物序列：5′⁃AAC GCTTCACGAATTTGCGT⁃3′。反应体系（20 μl）：50 mg/L cDNA 1 μl，10 μmol/L 正向/反向引物各0.5 μl，SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 μl，双蒸水8 μl。反应条件：95 ℃3 min，95 ℃10 s，61 ℃45 s，40 个循环。2－∆∆Ct法计算细胞中miR⁃203 水平，∆∆Ct=∆Ct目的基因－∆Ct内参。每次实验设6 个复孔，重复3次实验。
5.Western 蛋白免疫印迹法检测细胞中ZNF281 水平：收集细胞，添加蛋白裂解液，4 ℃10 000×g离心20 min，吸取上清液，BCA 试剂盒测定蛋白总浓度。每孔上样25 ng，聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，280 mA 转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；
对应加入一抗ZNF281（稀释比例1/5 000）、内参GAPDH（1/5 000），4 ℃孵育过夜；
加入对应二抗，室温孵育1.5 h。蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。蛋白表达相对值=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。每次实验设6 个复孔，重复3次实验。
6. CCK8 法检测miR⁃203 对A375、M14 细胞增殖能力的影响：各组细胞培养24 h 后，稀释成1 × 105个/ml，每孔100 μl 置于96 孔板中，分别于0、24、36、48、60、72 h 添加CCK8 试剂，继续培养2 h，酶标仪450 nm 处检测吸光度（A450），只添加培养基组作为空白对照，A450=A450实验孔－A450空白对照孔。
7. Transwell 检测miR⁃203 对A375、M14 细胞迁移能力的影响：调整细胞为5 × 103个/ml，每孔500 μl 接种于Transwell 小室中，培养48 h；
取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色5 min，流动蒸馏水清洗，显微镜下拍照并计数，每个小室5 个不重复视野计数并取平均值为该组细胞迁移数量。每次实验设6个复孔，重复3次实验。
8. 双荧光素酶鉴定miR⁃203 与ZNF281 的靶向关系：TargetScan 软件（http：//www.targetscan.org/vert_72/）查找ZNF281 mRNA 的3′UTR 与miR⁃203 结合位点。设计合成ZNF281 的3′UTR 野生型（3′UTR⁃WT）和3′UTR 突变型（3′UTR⁃MUT），分别与miR⁃203模拟物或miR⁃203模拟物阴性对照（miR⁃203 NC）共转染293T细胞，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测miR⁃203 NC+3′UTR⁃WT组、miR⁃203模拟物+3′UTR⁃WT 组、miR⁃203 NC+3′UTR⁃MUT 组、miR⁃203模拟物+3′UTR⁃MUT组荧光素酶活性。
9.统计学分析：采用统计学软件SPSS 24.0进行数据分析。多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK⁃q法。P<0.05认为差异有统计学意义。
二、结果
1.血管内皮细胞系和黑素瘤细胞系miR⁃203表达水平比较：各细胞系中miR⁃203 表达水平不同（F = 39.501，P <0.05）。A375、M14、SK⁃MEL⁃28、SK⁃MEL⁃2 中miR⁃203 表达（0.23±0.02、0.34±0.06、0.48±0.09、0.56±0.11）均显著低于ECV304（1.01 ± 0.21），差异有统计学意义（q = 9.057、7.514、5.682、4.650，均P<0.05）。因此，选miR⁃203 表达量差异较大的黑素瘤细胞系A375、M14进行下一步研究。
2.血管内皮细胞系和黑素瘤细胞系ZNF281 表达水平比较：各细胞系中ZNF281 表达水平不同（F = 35.701，P <0.001）。A375、M14、SK⁃MEL⁃28、SK⁃MEL⁃2中ZNF281蛋白表达（0.87±0.15、0.79±0.06、0.80±0.12、0.43±0.11）均显著高于ECV304（0.29 ± 0.06），差异有统计学意义（q =8.794、14.434、9.311、2.737，均P<0.05）。见图1。
3. 各组A375、M14 细胞miR⁃203 表达的情况：与对照组、miR⁃203 模拟物对照组、miR⁃203 抑制剂对照组相比，miR⁃203 模拟物组miR⁃203 水平较高（A375：q = 23.902、24.610、25.623；
M14：q=7.595、7.183、7.321），miR⁃203 抑制剂组miR⁃203 水平较低（A375：q = 10.985、11.425、15.669；
M14：q = 13.717、10.445、8.665），差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表1。
4. miR⁃203 对A375、M14 细胞增殖的影响：36、48、60、72 h，与对照组、miR⁃203 模拟物对照组、miR⁃203 抑制剂对照组相比，miR⁃203模拟物组A375、M14细胞增殖水平降低（A375：q36h= 6.311、9.417、7.564，q48h= 6.225、4.583、4.407，q60h= 3.775、4.457、3.997，q72h= 2.725、2.456、2.305，M14：q36h= 4.085、5.991、5.114，q48h= 6.171、7.652、5.353，q60h=5.465、5.571、4.603，q72h= 4.351、4.830、4.719，均P < 0.05），miR⁃203 抑制剂组细胞增殖水平升高（A375：q36h= 3.037、2.790、2.975，q48h= 3.676、3.001、4.740，q60h= 2.623、2.509、2.600，q72h= 2.622、2.615、2.409，M14：q36h= 2.421、2.327、2.378，q48h= 2.622、3.181、2.559，q60h= 2.410、2.278、2.096，q72h=2.056、1.926、1.887，均P<0.05）。24 h 时，miR⁃203 模拟物组A375、M14细胞增殖水平显著低于对照组、miR⁃203模拟物对照组、miR⁃203 抑制剂对照组（A375：q = 7.217、6.341、4.692，M14：q=4.656、6.114、4.974，均P<0.05）；
miR⁃203 抑制剂组M14 细胞增殖水平显著高于对照组、miR⁃203模拟物对照组及miR⁃203 抑制剂对照组（q = 5.289、5.661、4.426，均P<0.05），而miR⁃203 抑制剂组A375 细胞增殖水平与这3组差异无统计学意义（均P>0.05）。见图2。
组别对照组miR⁃203模拟物对照组miR⁃203抑制剂对照组miR⁃203模拟物组miR⁃203抑制剂组F值P值miR⁃203 A375 1.00±0.13 0.98±0.12 1.02±0.09 3.41±0.21a b c 0.39±0.04a b c 487.632<0.001 M14 1.01±0.06 1.03±0.11 0.99±0.13 2.05±0.33a b c 0.45±0.08a b c 68.454<0.001迁移数量（个）A375 35.48±4.38 36.84±5.41 37.16±6.13 19.36±4.61a b c 69.52±5.95a b c 70.193<0.001 M14 42.62±4.51 43.16±5.61 45.16±8.65 29.52±5.69a b c 75.16±8.31a b c 37.350<0.001 ZNF281 A375 1.12±0.21 1.16±0.19 1.12±0.23 0.86±0.15a b c 2.15±0.21a b c 37.514<0.001 M14 0.76±0.13 0.82±0.19 0.73±0.21 0.47±0.08a b c 1.01±0.25 6.826<0.001
5.miR⁃203 对A375、M14 细胞迁移的影响：与对照组、miR⁃203 模拟物对照组、miR⁃203 抑制剂对照组相比，miR⁃203 模拟物组A375、M14 细胞迁移数量较低（A375：q =6.209、6.024、5.685，M14：q = 4.420、4.181、3.700，均P <0.05），而miR⁃203 抑制剂组A375、M14 细胞迁移数量较高（A375：q = 11.286、9.954、9.279，M14：q = 8.340、7.818、6.126，均P<0.05）。见表1。
6.miR⁃203对A375、M14细胞中ZNF281蛋白表达的影响：miR⁃203 模拟物组A375、M14 细胞中ZNF281 蛋白表达显著低于对照组、miR⁃203模拟物对照组及miR⁃203抑制剂对照组（A375：q=2.468、3.036、2.319，M14：q=4.654、4.159、2.834，均P<0.05）。miR⁃203抑制剂组A375细胞显著高于对照组、miR⁃203 模拟物对照组及miR⁃203 抑制剂对照组（q=8.495、8.563、8.101，均P<0.05），而miR⁃203 抑制剂组M14细胞与对照组、miR⁃203模拟物对照组、miR⁃203抑制剂对照组差异无统计学意义（q = 2.173、1.482、2.101，均P >0.05）。见表1、图3。
图4 miR⁃203 与ZNF281 的靶向关系 miR⁃203 与ZNF281 存在15 个结合位点，在靶向位点连续结合的10 个位点建立ZNF⁃281突变序列（ZNF⁃281⁃MUT）
7.初步分析miR⁃203与ZNF281的靶向关系：TargetScan初步预测发现，miR⁃203 与ZNF281 之间存在靶位点见图4。根据靶向位点连续结合的10个位点建立ZNF⁃281突变型。荧光素酶实验验证二者的靶向关系显示，miR⁃203 NC+3′UTR⁃WT 组（1.00±0.17）、miR⁃203模拟物+3′UTR⁃WT 组（0.48 ± 0.06）、miR⁃203 NC + 3′UTR⁃MUT 组（0.96 ±0.13）、miR⁃203 模拟物+ 3′UTR⁃MUT 组荧光素酶活性（0.98 ± 0.15）差异有统计学意义（F = 20.950，P < 0.001）。与miR⁃203 NC + 3′UTR⁃WT 组相比，miR⁃203 模拟物+ 3′UTR⁃WT组细胞荧光素酶活性下降（q=7.065，P<0.05）。
三、讨论
目前，治疗恶性黑素瘤的常用方法为手术治疗，无法进行手术治疗的部分患者多采用放化疗，但效果不佳且有不良反应，因此寻找安全、有效的治疗方法是当前的临床热点。miR⁃203存在于染色体的不稳定脆性区域，是近年来发现的第一个皮肤特异性miRNA，其在转移性黑素瘤及黑素瘤细胞系中低表达，过表达miR⁃203 可抑制黑素瘤细胞运动、集落形成以及血管生成诱导能力；
在体内，miR⁃203还抑制异种移植肿瘤生长，并减少淋巴结和肺转移；
可作为黑素瘤的有效抑制剂［4］。本研究发现，黑素瘤细胞系A375、M14、SK⁃MEL⁃28、SK⁃MEL⁃2中miR⁃203表达水平显著低于血管内皮细胞系ECV304，提示miR⁃203水平降低可能与恶性黑素瘤发生发展有关；
A375、M14 细胞中，上调miR⁃203表达可降低细胞增殖活性及细胞迁移数量，下调其表达可增加细胞增殖活性及细胞迁移数量，表明miR⁃203 可调控A375、M14细胞增殖及迁移过程，抑制其表达可降低黑素瘤细胞增殖及迁移活性。
ZNF可通过促进细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成，抑制细胞凋亡、自噬及溶酶体生成等，介导肿瘤发生发展［5］。ZNF217高表达于结直肠癌组织中，且与结直肠癌患者的低生存率有关，而miR⁃203可通过抑制ZNF217表达降低结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭活性，从而缓解癌症进展［3］。抑制ZNF281 基因表达可降低直肠癌细胞活力并诱导细胞凋亡，且可增加及氟尿嘧啶化疗敏感性［6］。环状RNA circAGFG1 可与miR⁃203 竞争性地调控ZNF281 表达，通过circAGFG1/miR⁃203/ZNF281轴促进非小细胞肺癌的上皮间充质转化和转移［7］。ZNF281作为DNA结合蛋白，在肿瘤中研究较少，目前尚未见ZNF281在黑素瘤中的相关报道。本研究显示，黑素瘤细胞系A375、M14、SK⁃MEL⁃28、SK⁃MEL⁃2中ZNF281 蛋白表达显著高于血管内皮细胞系ECV304，提示ZNF281可能与黑素瘤的发生发展有关。下调A375、M14细胞miR⁃203 表达，可引起ZNF281 蛋白表达、细胞增殖活性及迁移细胞数均降低；
上调A375细胞miR⁃203表达，引起ZNF281 蛋白表达、细胞增殖活性及迁移细胞数增加，提示miR⁃203 可能通过调控ZNF281 蛋白表达，影响黑素瘤细胞的增殖和迁移。M14细胞中，上调miR⁃203表达可引起细胞增殖活性升高、迁移细胞数增加，但ZNF281 蛋白表达未见明显变化，可能与ZNF281蛋白受多种调控及不同黑素瘤细胞系的特性有关。进一步采用双荧光素酶鉴定miR⁃203与ZNF281的靶向关系显示，miR⁃203与ZNF281之间存在靶位点，miR⁃203 可能直接调控ZNF281。本研究只初步研究了两个黑素瘤细胞系中miR⁃203 与ZNF281 的关系及其对细胞增殖、迁移的影响，还应进一步通过上调或下调ZNF281表达进行验证，以进一步探索miR⁃203 调控恶性黑素瘤发生发展的机制。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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