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霍宁宁， 李研东， 霍惠玲， 韩 雪*， 苗玉涛
（1.河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050018；
2.河北省兽药饲料工作总站，河北石家庄 050035）
近些年，由“兽药残留”引发的食品安全问题和“耐药性传递”引发的生物安全问题备受关注。政府部门密集出台多项政策严控养殖投入品的规范使用。2019年农业农村部第194号公告的（中华人民共和国农业农村部公告，2019）颁布实施，标志着我国饲料行业正式步入“无抗时代”。在减抗大形势下，饲料中非法添加兽药（允许添加的品种除外）的情况仍屡屡发生。针对饲料中非法添加兽用药物进行监管是新政策出台后相关政府部门所面临的新挑战。
现有的兽药残留检测方法多是针对单一品种的已知目标物进行定量或定性分析，诸如中药材、动物尿液、兽药残留和食品中（王聪等，2021；
李岳等，2019；
苏燕，2019；
贺美莲等，2018；
潘晨松，2018；
孙雷等，2017）未知物筛查的分析报道较多，而针对高通量的、可同时检测上百种未知物的筛查方法很少，对基质更加复杂的预混合饲料中未知药物筛查的研究和标准则更少。本文采用超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱质谱进行检测，建立小分子筛查数据库，结合TraceFinder筛查软件分析，旨在通过建立适用于复合预混合饲料中未知药物的高通量快速筛查方法，为进一步优化完善饲料高通量检验方法，拓展更多兽用药物和非法添加物的筛查途径提供数据支撑，为政府部门的风险监测提供便捷而准确的技术路径，更好的为企业诸如原材料质量风险控制、成品监督及相关检验需求提供方法借鉴。
1.1 材料与试剂157种兽药标准品，First Standard，阿尔塔公司；
乙腈（色谱纯），默克；
蒸馏水，屈臣氏；
甲酸，赛默飞世尔科技公司。
1.2仪器与设备UltiMate 3000-Q-Exactive Focus，色谱柱Accucore RP-MS，Thermo公司。
1.3 试样溶液制备 称取复合预混合饲料样品2 g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，准确加入10 mL 50%乙腈水溶液，涡旋混匀3 min，超声提取30 min。12000 r/min离心10 min；
取上清液1 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤后，供质谱分析用。
1.4 液相色谱条件 色谱柱：Accucore RP-MS柱（100 mm×2.1 mm，粒径2.6 μm）；
柱温：30℃；
流动相A：0.05%甲酸水，流动相B：0.05%甲酸乙腈；
流速：0.3 mL/min；
进样量：5 μL。梯度洗脱条件见表1。
表1 色谱梯度洗脱程序
1.5 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI源），正负离子检测模式（ESI+、ESI-）同时扫描，扫描方式为一级全扫描/数据依赖型二级质谱扫描（FUll MS/dd-MS2），源区主要参数设置：鞘气流速为9 arb，喷雾电压为3 kV，毛细管（离子传输管）温度320℃，S-lens电压55 kV，辅助气加热温度30℃。质谱一级扫描模式为Full MS模式，扫描范围（m/z）100~900，一级分辨率70000，进入C-Trap的离子数目1e6，离子最大注入时间100 ms；
二级扫描模式模式dd MS2，二级分辨率35000，顶点激发时间3~6 s，设置阶梯碰撞能20、35、50 kV，动态排除时间8 s。采集数据前使用正负离子校正液进行质量轴校正。质谱采集数据通过Xcalibur软件提取化合物碎片离子信息，通过TraceFinder建立筛查数据库。筛查数据库信息见表2。
表2 筛查数据库信息
1.6 筛查结果判定 根据欧盟2002/657/EC准则（EU.Commission Decision，2002），应用高分辨质谱对目标化合物进行分析时，筛查规则中提出，有1个母离子和1个子离子、或2个子离子匹配则确证分析的样品含有该化合物（侯粲，2016）。对于疑似阳性样品，进一步在ddMS2模式下对其进行二级特征碎片离子扫描，当有2个或以上丰度较高的碎片离子与标准谱图中相应的碎片离子精确质量数偏差小于105，且碎片离子的相对丰度比在最大允许偏差范围内时，确证含有该化合物（侯粲，2016）。
对供试品溶液进行Full MS/ddMS2全扫描，根据建立的标准筛查数据库中的m/z精确质量数和保留时间对目标化合物进行筛查。当未知物保留时间在±0.5 min且母离子的精确质量数偏差在105、5 ppm范围内，子离子精确质量数在104、5 ppm范围内，同位素丰度比在70%范围内，检测结果为疑似阳性样品，否则判定为阴性样品。
2.1 空白样品和添加阳性样品筛查结果 在对空白添加样品进行快速筛查时，药物浓度50 ng/g时检出率为98.7%，添加药物浓度100 ng/g时药物检出率为100%，该方法可基本满足预混合饲料中非法使用兽药的高通量快速检测。根据实际样品检测结果，空白样品基质中有部分物质响应低（e3、e4），且出峰时间与添加阳性样品中的物质不对应，判断为样品中基质出峰。应用该方法处理样品采集数据并进行分析，能够应用于各种预混合饲料样品中非法添加未知药物的筛查工作，其正确率较高。空白样品部分物质图谱与添加阳性样品图谱见图1和2。
图1 空白样品部分物质色谱图
2.2 筛查未知物二级结构预测 在全扫描模式下，对HRMS参数进行优化，获得了高分辨率、高灵敏度的二级结构碎片离子（Suo等，2022）。该数据库所包含的药物大部分在ESI+电离模式下的响应值最大，容易获得H离子并形成[M+H]+；
几种物质在ESI-电离模式下的响应值最大，容易失去H离子并形成[M-H]-。在全扫描dd MS2条件下，毛细管电压和特征碎片离子参数完全优化，NCE值分别为20、35和50。通过Xcalibur软件中的分子拟合初步得到碎片离子的精确分子质量和分子式，计算母离子与碎片质量（M/Z）之差，判断物质脱落的部分结构，从而预测碎片的分子结构。如图3，选取部分代表性物质分析预测碎片离子结构。母离子质核比220.1443降低60 Da得到160.0869［M+H-60]+碎片离子，且该分子结构易脱落-1-羟基-2-异丙基氨基乙基部分结构，又知该分子式少了-C3H8O，故结构式如图中所示；
根据202.13383［M+H-18]+碎片离子的分子式相较于母体结构少了-H2O，故可推测该碎片离子结构式如图中所示。母离子质核比256.0880降低100 Da得到156.01141［M+H-100]+碎片离子，该物质磺胺酰基上的氢，可被不同杂环取代，又知分子式少了-C3H4N2S，故判断该碎片的结构式如图中所示；
108.04484［M+H-148]+碎片离子降低148 Da，结合分子式可知结构为磺胺酰基。同理分析得到8种代表性物质分析预测碎片离子结构见图3。
图3 8种代表性物质分析预测碎片离子结构
（续表2）
（续表2）
（续表2）
本文结合高分辨质谱的分辨率高、可准确定性、检测通量高的优势（李涛等，2017），建立了一种可应用于复杂基质饲料中非法添加物高通量筛查的快速、准确的定性检验方法。通过前处理后的样品进行上机检测，可快速锁定待测样品中非法添加物的种类，进而结合标准品准确的含量信息，对其进行定量，达到饲料中非法添加物的定量信息。
本文选择基质物质相对复杂的预混合饲料作为空白样本，旨在测试在复杂基质干扰下本方法的抗基质干扰能力。按照复合预混合饲料标签内容，该样品中含多种维生素、微量元素和氨基酸，基质相对配合饲料、浓缩料等产品复杂多样，对样品前处理要求更高。本方法在满足不影响检验效率的情况下，尽量简化前处理程序，以实现快速检验的目的，因此该方法可适用于预混合饲料、配合饲料、浓缩料、精料补充料和大多数常规的混合型饲料添加剂。单一饲料、饲料添加剂因其使用范围的局限性，通常为达到某种目的而使用某些特定品种或特定用途的药物，没有进行高通量非法筛查的必要，应作特定种类的药物定性定量检测。
对于药物的检出限和检出率，当157种药物添加浓度为50 ng/g时，检出155种，检出率为98.7%；
当药物添加浓度为100 ng/g时，157种药物全部检出，检出率为100%。在饲料中主观添加非法药物发挥抗病或治疗效果，按照药物饲料添加剂使用规程和兽医治疗用药规程，其添加浓度不会低于此浓度；
生产过程因不可控因素所带入的药物污染低于100 ng/g时，在机体内残留所产生的影响可以忽略，因此本文所选择的检测浓度已满足实际检测的需要。
目前，筛查方法基于检验的非法添加物筛查数据库仍在进一步扩充，数据库药物种类和数量会陆续增加和完善，前处理方法也会因药物种类的增加而进一步优化，拓宽基质考察范围，优化前处理条件，开发兼容性更强、更高通量的前处理方法（郭添荣，2021）是未来发展的方向。某些特殊药物、特殊基质的样品会在今后的实验中进一步开发和增加，提高实验的灵敏度和精确度也是需要考虑的，以更加充分发挥高分辨质谱的优势。
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