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唐爱明，陈智，谭丹，郑姣妹，王辉，罗湘，赖诗嘉，刘增再，王洪亮
（长沙市动植物疫病预防控制中心 长沙 410007）
高致病性禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）、鸡新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）、禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）、鸡白痢（pullorum disease，PD）、禽巴氏杆菌（pasteurella multocida，PM）是近年来规模种鸡场国家中长期计划重点监测和净化的疫病病原[1]。
为推动养禽业发展，减少禽白血病等主要疫病对种禽养殖的经济损失，提供优质禽肉及其产品[2]，建设长沙食品安全城市，规模化种鸡场在结合自身实际的前提下，尽可能净化更多病种，以最大限度提升动物健康指标，增强经济效益。根据农业农村部《规模化种禽场主要疫病净化评估标准》[3]，结合2018—2021 年《湖南省动物疫病监测与流行病学调查计划》，长沙市动植物疫病预防控制中心在长沙地区部分商品化种鸡场，开展禽流感、新城疫、禽白血病、鸡白痢、禽巴氏杆菌病等主要疫病的血清学和病原学检测，对检测结果进行评估、分析，为长沙市种禽场主要疫病净化提供重要的决策依据[4,5]。
1.1 材料
2018—2021 年，中心实验室在每年春防秋防、冬春季流感监测、日常监测采样时，按照农业农村部兽医局规模化种禽场主要疫病净化评估标准抽样方案，抽样数量按照无疫证明公式计算：血清学按照每个场抗体阳性率90%，可接受误差5%，置信度95%，期望90%，误差10%，随机抽样；
病原学按照置信度95%，预期流行率1%，随机抽样，覆盖不同栋种鸡群，按国家规定采集种鸡蛋、鸡血、咽喉和泄殖腔拭子，每个种鸡场根据饲养数量采集不同类型样品40～50 份，鸡蛋、鸡血和鸡拭子一一对应，抽检27 周龄以上种鸡，共采集2,700 份样品[6]。
1.2 试剂
血清学试剂：H5/H7 亚型AIV 血凝抑制试验抗原、AIVH5/H7阳性血清（AIVH5Re-11 株、AIVH5Re-12 株、AIVH7Re-2 株、AIVH7Re-3 株），购自哈尔滨维科生物技术开发公司；
ND 血凝抑制试验抗原、ND 阳性血清，哈尔滨国生生物公司生产。
ELISA 试剂：ALV 病毒ELISA 抗原检测试剂盒，购自哈尔滨国生生物公司和北京爱德士元亨生物公司[7]。
PD 平板凝集试验抗原、PD 阳性血清，购自哈尔滨国生生物公司。
病原学试剂：禽流感AIV H5/H7 核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、新城疫ND 核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、禽巴氏杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），购自中山大学达安基因公司；
核酸提取试剂盒：购自西安天隆公司。
PM 鉴定：5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂培养基，杭州天和微生物试剂公司；
GN 革兰氏阴性细菌鉴定卡，法国梅里埃公司生产。
1.3 主要仪器设备
恒温培养箱、MK3 酶标仪、西安天隆N968 核酸提取仪、罗氏Roche LightCycler480 实时荧光定量PCR 仪、法国梅里埃全自动微生物鉴定/药敏分析系统。
1.4 方法
AIV、ND 免疫抗体检测采用血凝和血凝抑制试验，AIV、ND 病原检测采用荧光RT-PCR 方法；
PD 感染抗体检测采用全血平板凝集试验；
ALVP27 抗原检测采用酶联免疫吸附试验，PM 病原检测采用荧光RT-PCR 方法和细菌鉴定。具体检测病种、样品类型、检测依据及检测方法见表1。
表1 检测项目及其方法
1.5 判定标准
禽流感、新城疫免疫抗体结果判定：依据GB/T 18936-2020 和GB/T 16550—2020 最新国家标准，HI 效价≥4log2 判为鸡血清抗体效价阳性。根据湖南省多年的疫病监测要求，禽流感、新城疫经血凝抑制试验（HI）检测，对灭活疫苗免疫的家禽，免疫21d 后HI抗体效价≥4log2 为免疫合格。
鸡白痢感染抗体结果判定：按照NY/T 536—2017 农业行业标准，50%（++）以上凝集，出现明显的紫色凝集颗粒，反应液较为混浊为阳性，其余均为阴性。
禽白血病P27 抗原ELISA 检测，禽流感、新城疫、禽巴氏杆菌荧光PCR 病原检测，禽巴氏杆菌细菌鉴定，均按照检测试剂盒提供的说明书进行结果判定和分析。
2.1 禽流感、新城疫免疫抗体监测
2018—2021 年长沙部分规模种鸡场血清学检测结果见表2。由表2 可以看出，4 年共对长沙市5 个种鸡场900 份鸡血清样品进行AIV H5、AIV H7、ND 免疫抗体监测，抗体合格率分别为98.8%、98.8%、99.8%，种鸡场禽流感、新城疫免疫抗体水平在95%以上，均达到农业农村部规模化种禽场抗体合格率90%以上的免疫净化评估标准，表明种鸡场3 种病原的抗体保护水平较高。为减小实验误差，一定要确保1%的红细胞配制准确，控制好反应温度和作用时间，同时做4、2、1、0.5、0.25 和0.12HAU 抗原的回滴实验，确保结果准确。
表2 种鸡场禽流感、新城疫免疫抗体检测结果汇总表
2.2 病原学监测结果
1）不同年份病原感染情况2018—2021 年，5 个种鸡场均未检测到AIV H5、AIV H7、NDV 核酸阳性，说明禽流感、新城疫基本达到了无疫状况；
2018—2021 年，部分种鸡场检测到ALV、PD 病原学阳性，分别在2018 年和2020 年，结果见表3 和表4，个体阳性率分别为0.78%、0.44%；
2018—2021 年，5 个种鸡场均未检测到PM 核酸阳性。所有种鸡场，只要检测到AIV、NDV、ALV、PD、PM 病原学阳性个体，均应及时进行淘汰，同笼鸡可选择出售，不再作为繁育留种个体。
表3 5个种鸡场连续4年的病原学检测结果汇总表
表4 2018-2021年种鸡场病原学阳性率统计结果
2）不同病原感染情况2018—2021 年长沙部分规模种鸡场病原学检测结果汇总，见表5。由表5 可以看出，4 年共对长沙市5 个种鸡场鸡咽喉/泄殖腔拭子样品进行禽流感H5、禽流感H7、鸡新城疫、禽巴氏杆菌病毒核酸监测，病原学监测结果均为阴性。禽白血病、鸡白痢在2018 年和2020 年均检测到阳性。
表5 种鸡场病原学阳性场统计结果
3）不同种鸡场感染情况5 个种鸡场连续4 年的病原学检测结果见表6，结果显示：A 场AIV、NDV、PD、PM 病原学连续4 年保持阴性，ALV 偶有检出，分别为1.2%和0.8%阳性率，出现阳性鸡只，及时采取措施，进行淘汰净化；
B 场连续4年AIV、NDV、ALV、PD、PM 病原学检测结果均为阴性；
C 场AIV、NDV、ALV、PM 病原学连续4 年保持阴性，PD 在2018年和2020 年检出阳性，阳性率分别为1.9%和1.6%，淘汰阳性个体进行净化，2021 年PD 抽检结果为阴性；
D 场AIV、NDV、PD、PM 病原学连续4 年保持阴性，2018 年和2020 年检出ALV 阳性，阳性率分别为1.5%和0.5%，2019 年和2021年未检出ALV 阳性；
E 场AIV、NVD、ALV、PD、PM 病原学连续4 年均保持阴性。
表6 5个种鸡场连续4年的病原学阳性率统计（%）
3.1 禽流感
长沙市在提升动物疫病防控能力方面，措施得力，每年主动开展春秋防禽流感病原和血清学监测，冬春季禽流感专项监测，全面开展流行病学调查，发现禽流感阳性场点，及时采取应对措施。禽流感是国家强制免疫的三大病种之一，长沙地区规模养禽场强制免疫疫苗资金直接补贴试点稳步推进，整体免疫到位[8]。本次监测发现，长沙市5 个种鸡场AIV5/H7 核酸检测结果均为阴性，且每年免疫抗体平均在97.6%以上，免疫效果良好。
3.2 新城疫
湖南省市两级科学制定免疫程序，开展新城疫免疫抗体监测，在种鸡场群体免疫评估工作中发挥了重要作用。长沙地区商品化种鸡场大多使用某知名品牌禽流感、新城疫、支气管炎、减蛋综合征四联苗免疫，免疫效果好，2018—2021 年5 个种鸡场新城疫免疫抗体平均在99.5%以上，基本做到免疫无疫。
3.3 禽白血病
近年来，长沙市持续开展种禽场禽白血病等主要疫病防控与净化技术研究[9]，按照国家疫控中心2020 年种鸡场主要垂直传播性疫病净化要求，开展净化工作，积极探索商品化种鸡场禽白血病净化技术规范。2018—2021 年5 个种鸡场禽白血病监测，种蛋和咽喉泄殖腔棉拭子偶有阳性检出，发现阳性个体，及时采取措施，进行淘汰，逐步净化，争取创建几家禽白血病净化示范场，培育优质生态种禽养殖企业，打造从农场到餐桌的绿色家禽产品品牌，提高养殖经济效益，向国家相关部门提供决策支持。
3.4 鸡白痢
鸡白痢净化是一项长期持久的工作，鸡白痢可以水平和垂直两种方式进行传播。长沙市持续开展鸡白痢净化工作，在春秋防免疫效果评估和冬春季禽流感血清学监测时，进行鸡白痢感染抗体检测，检测结果显示，规模种鸡场阳性极少，偶有个例发生，相关鸡场立即淘汰阳性鸡，对全场环境进行消毒，严格生物安全操作。同时对阳性鸡群加大监测力度，检测，阳性淘汰，再检测，阳性淘汰，消毒，直至达到国家疫控中心净化评估标准。
3.5 禽巴氏杆菌病
禽巴氏杆菌病即禽霍乱，为养禽场常见细菌性疾病。禽巴氏杆菌为条件致病菌，当禽舍通风状况良好，平时防疫措施包括免疫接种、定期消毒、驱蚊灭鼠等措施到位时，基本不会发病。规模养鸡场最好配备专业兽医技术人员进行饲养管理，定期做好鸡群免疫，发现可疑病例，及时采取措施，早诊断，早治疗，科学用药，减少经济损失。长沙地区5 个规模种鸡场连续4 年来暂未监测到禽巴氏杆菌病阳性。
对长沙地区5 个大型商品化种鸡场连续4 年对5 个动物病种的监测表明：各个种鸡场禽流感、新城疫、禽巴氏杆菌得到了有效控制，基本达到国家疫控中心净化评估要求。而部分种鸡场偶有禽白血病、鸡白痢感染，需通过检测，阳性淘汰，再检测，消毒，通过综合防控和净化措施，减少甚至根除种禽场禽白血病和鸡白痢，改善养殖生态环境，提高生态效益，力争创建几家禽白血病和鸡白痢等主要疫病净化示范场[10]。
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